Разделы: Биотехнологии, Ветеринария, Медицина
Размещена 20.04.2014. Последняя правка: 19.04.2014.
Просмотров - 4705

СОВЕРШЕНСТОВАНИЕ КЛАССИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕБСИЕЛЛЕЗНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ

Садртдинова Гузелия Рафиковна

Ульяновская ГСХА им.П.А.Столыпина

аспирант

Ляшенко Е.А. кандидат биологических наук.,доцент; Васильев Д.А. доктор биологических наук.,профессор, Ульяновская ГСХА им.П.А.Столыпина

УДК 579

В последнее  время научно-исследовательские лаборатории многих стран (в т.ч.и России)особое внимание уделяют диагностике инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относятся клебсиеллезные инфекции. 
Представители рода Klebsiella достаточно широко распространены в природе. Так, если в 90-ые годы XX века насчитывалось около 5-6 видов бактерий данного рода, то сегодня их более 12 (Kl.pneomoniae, Kl.ozaenae, Kl.rhinoscleromatis, Kl.ornithinolytica, Kl.oxytoca, Kl.planticola, Kl.terrigena, Kl.mobilis, Kl.singaporensis, Kl.granulomatis, Kl.variicola, Kl.aerogenes, Kl.milletis, Kl.sinegalensis).  Большинство видов еще малоизучены,  о степени патогенности, области распространения сложно что-либо сказать точно. Все еще находится в процессе изучения и представляет собой огромный интерес для ученых. 

Клебсиеллы — это сравнительно устойчивые бактерии. При нагревании до 65°С погибают через 1 час, но при комнатной температуре могут сохраняться месяцами. Среди этих микроорганизмов имеются патогенные варианты, способные вызывать у животных и людей самостоятельные заболевания.

Исследования по изучению бактериофагов, (уже с 1915 года) позволили широко использовать их для решения многих задач в микробиологии, вирусологии, генетике, биохимии, иммунологии, радиобиологии, биотехнологии и других областях биологических исследований.  Фаги являются одним из наиболее подходящих объектов для глубокого изучения ряда вирусологических проблем и, в частности, взаимоотношения вируса с клеткой-хозяином. При их использовании, возможно, моделировать как явно выраженную продуктивную инфекцию, так и потенциальное вирусоносительство в форме лизогении.

В ветеринарии и медицине практическое использование фагов связано с изучением наследственной изменчивости бактерий (трансдукция, фаговая конверсия), индикацией и идентификацией патогенных бактерий, фаготерапией и фагопрофилактикой.

Однако в течение двух последних десятилетий преобладало мнение, что изучение фагов уже не может дать науке ничего принципиально нового. В России в момент возникновения генной инженерии произошел резкий отход от изучения фагов в пользу лучше финансируемых исследований. Лишь несколько лабораторий в России продолжают до настоящего времени фундаментальные исследования фагов. 

Исследования с использованием фагов позволили раскрыть механизмы таких фундаментальных биологических процессов, как репликация ДНК, рекомбинация, транскрипция и генная регуляция. Благодаря изучению фагов открылись также возможности разработки многих важных методов и направлений генной инженерии.

В наличии у лабораторий отсутствуют диагностические клебсиеллезные фаги. Следовательно, получение специфических фагов, активных в отношении бактерий данного рода, является актуальным.

Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА им.П.А.Столыпина определила одно из приоритетных научных направлений - выделение и изучение бактериофагов. На кафедре в сотрудничестве с ведущими научными центрами страны (ВНИИВСГЭ, ВГНКИ, ВНИИЗЖ, ВНИИВиМ) более тридцати лет ведется научно-исследовательская работа по этой проблеме, в частности, изучение бактериофагов малоизученных в ветеринарии энтеробактерий.Выбор этого научного направления связан с тем, что в последние годы, благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей, расширилось представление об этиологическом значении бактерий семейства Enterobacteriaceae в патологии животных и человека. Представители этого семейства широко распространены в природе и большинство из них является нормальной микрофлорой желудочно-кишечного тракта животных и человека. Однако среди этих микроорганизмов имеются патогенные рода, виды и варианты, способные вызывать у животных и людей как самостоятельные заболевания (эшерихиоз, сальмонеллез, иерсиниоз, клеб- сиеллез и др.), так и энтериты, нагноение ран, абсцессы, маститы, эндометриты, менингиты, пневмонии, сепсис и т. п., пищевые и кормовые токсикозы и токсикоин-фекции и др.

Имеющаяся на сегодняшний день схема выделения бактериофагов бактерий рода Klebsiella, признанная как классическая, имеет ряд недостатков, основным из которых является ее трудоемкость (большой расход сред, времени).  Поэтому  цель данного исследования заключалась в  разработке оптимальной схемы выделения бактериофагов бактерий рода рода Klebsiella.

Материалы и методы исследования. Основным этапом наших исследований стало выделение бактериофагов из объектов внешней среды. Материалом служили следующие объекты: сточные воды и образцы земли  фермерского хозяйства (Тереньгульский р-он, Ульяновской области), кровь МРС (больные свиньи), фекалии (куриные).

Все образцы (4 образца) фильтровали через бумажный фильтр для освобождения от механических примесей. В колбу, содержащую стерильный МПБ в количестве 50 миллилитров, вносили 20 мл фильтрата каждого образца и по 1 мл всех имеющихся у нас штаммов бактерий рода Klebsiella (13 музейных штаммов кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА им.П.А.Столыпина). Таким образом, каждый образец испытывался на наличие фагов ко всем имеющимся культурам бактерий рода Klebsiella. Колбу помещали в термостат и инкубировали в течение 5 дней при 37 °С. После этого содержимое колбы разливали в стерильные пробирки, центрифугировали, одну из пробирок с супернатантом обрабатывали хлороформом (в разведении 1 : 10), а вторую прогревали в водяной бане при 58 – 60 °С в течение 30 минут. Такая обработка смеси позволяет выделить термоустойчивые фаги и фаги, устойчивые к воздействию хлороформа.

Результаты и выводы исследования. Полученные пробы исследовали методом «стекающей» капли. Для этого на 13 чашках с МПА были «разбиты» 8 секторов (4 по темературе и 4 по устойчивости к хлороформу). Чашки ставили в термостат на 18 – 24 часа при 37 °С. Наличие негативных колоний или зон лизиса на газоне роста индикаторной культуры свидетельствовало о присутствии в исследуемом материале бактериофага (таб.1).

Таб.1- Результаты исследования

Индикаторная культура	Результаты исследования
	t- устоичивость	хл-ф-устойчивость
K. pneumonia №5006	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №45/1	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №76	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №53	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №49	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №5007	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №2	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №85/2	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №1	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №81/1	сплошной газон	в секторе «З» наблюдаются фаговые бляшки небольшого размера
K. pneumonia №532	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №244/1	сплошной газон	сплошной газон
K. pneumonia №5202	сплошной газон	сплошной газон

 

В результате проведенных исследований было установлено, что бактериофаг имелся лишь в образце с землей. Причем, данный фаг можно охарактеризовать как устойчив к обработке хлороформом и не термостабилен. Индикаторной культурой данного фага является штамм K. pneumonia №81/1

Разделение чашки с МПА на сектора, позволило нам одновременно происследовать 4 образца патологического материала всех 13 клебсиеллезных штаммов. Результаты были наглядно представлены в сравнении, что облегчило формулировку выводов.

1. Габрилович И.М. Основы бактериофагии. // Минск: «Высшая школа», 1973.
2. Габрилович И.М., Азаматова А.Б., Хакешева Т.А. Об использовании бактериофагов для идентификации клебсиелл // Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике. М., 1983. С. - 139 -140.
3. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. Киев: Урожай, 1978. - С. 88.
4. Kaur K., Kaul M., Chhiber S. Enterotoxigemicity, klebocinogeny and antibiotic resistance pattern of food isolated of Klebsiella pneumoniae // Folia Microbiol. 1988. - V. 3, № 6. - P. 500 - 506.
5. Podschun R., Penner I., Ullmann U. Interaction of Klebsiella capsule type 7 with human polymorphonuclear leucocytes // Microb. Pathog. 1992. -V. 13.-P. 371 -379.

Рецензии:

7.05.2014, 7:47 Ступко Валентина Юрьевна
Рецензия: Актуальность работы авторами доказана. Однако из текста работы не ясно, за счёт чего оптимизируется схема выделения. В результатах описаны итоги исследований образцов, а не заявленный в цели работы процесс оптимизации классической схемы выделения.Хотелось бы видеть "классическую методику" и методику авторов в сравнении. Что именно изменили, как это отразилось на получаемых результатах? Они такие же, как и при использовании классической схемы? Вообще, мне кажется, имеет смысл всё же описать классическую схему, хотя бы в общих чертах. Если вы рассчитываете на широкий круг читателей-биологов. С уважением, Ступко В.Ю.

21.06.2014, 21:47 Лахтин Юрий Владимирович
Рецензия: Одним из требований к классической научной статье обязательным является ссылки на литературные источники, чего в данной работе нет.

16.07.2014, 22:14 Остапенко Ольга Валериевна
Рецензия: Бросается в глаза не соответствие объема введения и результатов и выводов в статье. Выводы четко не сформулированы. После доработки статью можно подавать в печать.



Комментарии пользователей:

24.07.2019, 1:16 Мирмович Эдуард Григорьевич Отзыв: Статья выправлена и стала интересной. С уважением к.ф.-м.н., доц. Эдуард Григорьевич Мирмович

Оставить комментарий