Статья опубликована в №36 (август) 2016
Разделы: Медицина
Размещена 13.08.2016. Последняя правка: 21.08.2016.
Просмотров - 3966

Ферментативная протеолитическая активность, которая определяется в биологических объектах

Прудников Александр Русланович

магистр медицинских наук

УО "Витебский государственный медицинский университет"

ассистент

Щупакова Алина Николаевна, доктор медицинских наук, профессор кафедры внутренних болезней №1 УО Витебский государственный медицинский университет, Окулич Виталий Константинович кандидат медицинских наук, доцент кафедры клинической микробиологии УО Витебский государственный медицинский университет

УДК 616-01/-099

Актуальность. Протеазы играют ключевую регуляторную функцию в процессах оплодотворения, родов, пищеварения, роста, а также в процессах созревания, старения и смерти всех клеток. Они регулируют практически все физиологические процессы, управляя активацией, синтезом и деградацией белков как высших, так и низших организмов. Протеазы играют важную роль в жизнедеятельности вирусов, бактерий и паразитов, облегчая их инвазию и распространение внутри макроорганизма, а также эффективное размножение, обеспечивая защиту от барьерных сил и системы иммунитета макроорганизма [1].

В последние десятилетия множество научных разработок посвящено изучению фермента эластазы [2]. Эластаза – это эндопептидаза, которая разрушает нерастворимые матриксные белки, в том числе и эластин, как в норме (например, в процессе обновления внеклеточного матрикса), так и при различных формах патологии. Существует также множество ферментов, обладающих эластазной активностью либо непосредственно определяемые как разновидность данной пептидазы (приведем некоторые примеры): три сериновые протеиназы (нейтрофильная эластаза-2, катепсин G, протеиназа-3), четыре металлопротеиназы (желатиназа А и Б, матрилизин, макрофагальная эластаза-12) и четыре цистеиновые протеиназы (катепсины L, S, K, V). У млекопитающих эластаза вырабатывается главным образом в поджелудочной железе и в фагоцитах [3]. Среди низших организмов данный фермент вырабатывается лишь некоторыми видами микроорганизмов (например, синегнойной палочкой) [3].

Различные виды эластазы участвуют в физиологических процессах: в расщеплении внеклеточного матрикса, при переваривании пищи (панкреатический тип), при обновлении соединительной ткани и уничтожении микроорганизмов (макрофагальный и нейтрофильный типы), но также играют важную роль в патогенезе муковисцидоза, эмифиземы легких и других форм патологий, сопровождающихся воспалением [4,5].

В сыворотку крови панкреатическая эластаза-1 попадает только из поджелудочной железы, поэтому определение фермента является важным для диагностики заболеваний этой железы. В крови здоровых людей активность панкреатической эластазы-1 почти не определяется или очень низкая. Панкреатическая эластаза-1 играет важную роль в патогенезе острого панкреатита. Её активность повышается в первые 48 ч после начала приступа острого панкреатита почти у 100 % пациентов, а затем постепенно снижается. Активность эластазы-1 повышается в крови при остром и обострении  хронического панкреатита раньше, чем уровень других ферментов, еще на субклинической стадии [6]. Т.к. период полураспада панкреатической эластазы-1 дольше, чем амилазы и липазы, то и период выявления повышенной её активности в крови длиннее [6]. Это означает, что данный фермент может использоваться как потенциальный маркер развития острого и обострения хронического панкреатита.

Лейкоцитарную (макрофагальную и нейтрофильную) эластазу считают маркером хронических и острых воспалительных заболеваний, который отражает степень дегрануляции и активации нейтрофильных лейкоцитов и макрофагов. Активность лейкоцитарной эластазы оценивается при комплексной диагностике синдрома полиорганной недостаточности, а также заболеваний, сопровождающихся выраженным, плохо контролируемым воспалением [4,5].

Выделение эластазы из нейтрофилов в экстрацеллюлярное пространство происходит под влиянием различных субстанций: цитокинов (ФНО-α, ИЛ-8), липополисахарида, фрагментов бактериальной стенки. Инактивация НЭ осуществляется преимущественно α1-антитрипсином и частично β2-макроглобулином, а также менее изученными секреторным лейкоцитарным протеазным ингибитором, элафином и эглином С, относящимися к семейству серпинов. Несмотря на значительные резервы ингибиторов протеаз (кроме случаев дефицита α1-антитрипсина), имеющиеся в любом организме, существуют механизмы, помогающие нейтрофилам реализовать свой деструктивный потенциал. Во-первых, нейтрофилы выделяют оксиданты, окисляющие активный центр антитрипсина, делая его функционально неактивным [9]. Во-вторых, связавшись с эластином экстрацеллюлярного матрикса, НЭ становиться неуязвимой для серпинов [10]. Избыточная продукция НЭ либо невозможность ее адекватного ингибирования наблюдается при целом ряде заболеваний, из которых наиболее значимыми являются эмфизема легких и муковисцидоз [4].

Наиболее изучена роль НЭ в механизмах развития эмфиземы легких как результата расщепления эластина экстрацеллюлярного матрикса легочной паренхимы. В деградацию альвеолярных стенок при эмфиземе, помимо НЭ, вовлечены и другие группы протеаз, прежде всего, матриксные металлопротеиназы, являющиеся продуктом нейтрофилов (ММП-8, ММП-9) и макрофагов (ММП-1, 2, 3, 7, 9, 12). Однако, в отличие от сериновых протеаз, ММП выделяются в межклеточное пространство в неактивной форме. Для реализации своего протеолитического потенциала данные протеазы должны быть активированы, и одним из индукторов их активности выступает НЭ [11]. В свою очередь, ММП подавляют активность антитрипсина, предохраняя, таким образом, НЭ от инактивации [12]. Следовательно, помимо прямого эластазного эффекта, НЭ опосредованно влияет и на деструкцию других компонентов ЭЦМ — коллагена и желатина металлопротеиназами.

Синтезировать эластазу так же могут и микроорганизмы. Выделяясь в окружающую среду, микробная эластаза играет роль фактора агрессии и инвазии и помогает микроорганизмам преодолевать защитные барьеры макроорганизма, она расщепляет крупные молекулы до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки, таким образом, обеспечивая бактерии субстратами для образования энергии и полимеров [13,14].

Однако, по данным литературы, не все микроорганизмы способны синтезировать эластазу, а только некоторые изоляты синегнойной палочки. [15].

Рассматривая роль различных видов эластаз (панкреатической, нетрофильной, бактериальной) в патогенезе многочисленных заболеваний, можно сделать вывод, что разработка новых методов определения протеолитической активности ферментов, в биологических жидкостях, у микроорганизмов и изучение изменения данной активности при различных патологических процессах представляет научный и практический интерес для разработки новых методов диагностики и лечения.

Материалы и методы исследования.

1. Получение биологических материалов

Было получено информированное добровольное согласие пациентов на получение от них биологических жидкостей для проведения исследований.

Биологический материал для проведения исследования включает:

а) Получение сывороток крови.

Кровь забиралась натощак с 8 до 9 часов утра из локтевой вены, центрифугировалась со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 10 минут; сыворотка отбиралась, замораживалась и хранилась при –25⁰ С.

Была исследована протеолитическая активность сыворотки крови у 9 (26%) доноров и 26 пациентов с острым панкреатитом, 19 (54%) из которых имели диагноз острый панкреатит без панкреонекроза, а 7 (20%) пациентов имели очаги некроза в поджелудочной железе.

Также исследовали протеолитическую активность сыворотки у 35 пациентов с различными формами ИБС (ИБС: стабильная стенокардия напряжения 1-3 ФК (n=18); инфаркт миокарда различной локализации (n=5); ОКС с подъёмом и без подъёма ST (n=7) и др.) и 25 практически здоровых доноров из УЗ «ВОСПК».

Исследовали протеолитическую активность сывороток крови у 23 беременных женщин с инфекционной патологией. Забор сыворотки крови брали у пациентов, находившихся на лечении на базе УЗ «БСМП», кардиологического отделения УЗ «ВОКБ» и родильного дома № 3 города Витебска соответственно.

б) Получение препаратов ротовой жидкости.

Для определения эластазной активности забор ротовой жидкости производили на базе отделения челюстно-лицевой хирургии ВОКБ (20 образцов ротовой жидкости больных с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области) и у студентов без гнойно-воспалительной патологии ротовой полости (n=22).

в) Выделение изолятов микроорганизмов.

Исследована эластазная активность 42 изолятов микроорганизмов, из которых 6 изолятов – E. coli, 12 изолятов были S. aureus и 24 – P.aeruginosa. Изоляты микроорганизмов были получены из гнойного отделяемого ран у пациентов, находившихся на лечении в ожоговом, гнойном хирургическом отделениях и РАО на базе УЗ «ВОКБ».

Мы исследовали частоту встречаемости и уровень БАПНА-амидазной активности у основных видов возбудителей хирургической инфекции. Нами была определена БАПНА-амидазная активностьу 167 изолятов микроорганизмов, выделенных от хирургических пациентов с гнойно-воспалительными процессами (таблица 1).

Таблица 1 – Изоляты микроорганизмов, у которых исследовалась БАПНА-амидазная активность

Идентификация микроорганизмов проводилась с помощью тест-систем на автоматизированном биохимическом анализаторе АТВ Expression фирмы «bioMerieux».

2. Определение БАПНА-амидазной активности биологических материалов

Определение БАПНА-амидазной активности было сделано в несколько этапов:

а) Постановка реакции для определения БАПНА-амидазной активности сывороток крови.

Для определения БАПНА-амидазной активности сывороток в качестве субстрата протеолиза использовали бензоиларгинин-р-нитроанилид. Выбор субстрата обусловлен тем, что распад БАПНА происходит только в результате расщепления амидной (аналога пептидной) связи по аминокислотам Arg-Lis. В лунки плоскодонного стерильного планшета для ИФА вносилось 0,2 мл раствора БАПНА (24 мг БАПНА растворяется в 0,9 мл диметилсульфоксида и доводится до 30 мл 0,05М трис-NaOH буфером-рН 7,4) и 0,005 мл исследуемой сыворотки. Учет результатов реакции осуществлялся после 20-ти часовой инкубации при температуре 37,6° С на анализаторе иммуноферментном фотоэлектрическом при длине волны 410 нм. Для пересчета полученного результата в пикокаталы нами была использована формула, а также калибровочный график (рисунок 1): 

Y = 0,028+11ЧE_оп   

где Y – искомый результат;

Е_оп  - оптическая плотность пробы минус оптическая плотность контроля.

Рисунок 1 - Калибровочный график для определения БАПНА-амидазной активности

б) Постановка реакции для определения БАПНА-амидазной активности амниотической жидкости.

Реакционная смесь состояла из 0,2 мл раствора БАПНА (24 мг БАПНА растворяется в 0,9 мл диметилсульфоксида и доводится до 30 мл 0,05М трис-NaOH буфером-рН7,4) и 0,005 мл исследуемой амниотической жидкости.

в) Постановка реакции для определения БАПНА-амидазной активности микроорганизмов.

Для исследований использовали суточную чистую культуру микроорганизмов, выращенных на мясопептонном агаре. На физиологическом растворе готовили взвесь микроорганизмов в концентрации 10⁹ на 1 мл, что соответствует оптической плотности 0,83 единиц экстинции при длине волны 550 нм и оптическом пути 1 см при измерении на спектрофотометре, или 3,3 ЕД МcFarland при измерении на денситометре, или 10 ЕД стандарта Центрального государственного научного контрольного института имени Тарасевича (Россия).

Далее в лунку планшета для иммуноферментного анализа вносили по 0,1 мл исследуемой взвеси бактерий и 0,1 мл раствора БАПНА. Для улучшения воспроизводимости метода, учитывая коэффициент внутрианализной вариации 3,7%, определение активности производили в триплетах. В качестве отрицательного контроля использовали 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл раствора БАПНА, положительного контроля - стандартный штамм микроорганизма с заведомо положительной активностью, например P. aeruginosaATCC 27853 или 0,01% раствор р-нитроанилида.

3. Метод определения эластазной активности в биологических жидкостях

Нами была модифицирована методика определения эластазной активности в биологических жидкостях [16,17].

В качестве субстрата в данной методике выступает эластин-Конго красный (диаметр частиц 37-75 микрон). При взаимодействии с эластазой, последняя разрушает эластин, и конго-Красный переходит в раствор, изменяя его цвет с прозрачного на красный с максимальным спектром поглощения 495 нм (рисунок 2).

Однако данная методика обладает рядом недостатков:

1. Потребность в дорогостоящих фильтрах c диаметром пор 0,8 µм, которые были предназначены для отделения раствора от непрореагировавшего эластин-Конго красного.

2. Использование пробирок. При работе с малыми объемами жидкости это доставляет ряд неудобств.

3. Данная методика не позволяет изучать эластазную активность микроорганизмов.

 

Рисунок 2 – Снимок частиц эластазы до и после инкубации, полученный на конфокальном микроскопе LeicaTCSSPE

Суть модификации методики для определения эластазной активности биологических жидкостей заключалась в замене дорогостоящих фильтров на центрифугирование и использование вместо пробирок эппендорфов.

Постановка метода:

1. Биологическая жидкость перед применением центрифугировалась 1,5 тыс. об/мин в течение 10 мин.

2. Реакционная смесь в опытных пробах состояла из 400 мкл раствора эластин-Конго красного в концентрации 0,8 мг на 1 мл трис-НСl буферного раствора с требуемым рН (показатель зависит от типа фермента) и 100 мкл исследуемой биологической жидкости (опытным путем было установлено, что наилучший результат получается при использовании данного объема). В контрольные пробах вместо биологической жидкости вносился буферный раствор с соответствующим рН.

3. Компоненты реакционной смеси последовательно вносились в эппендорфы, и инкубация проб проводилась в термостате при Т=37°С в течение 24 часов.

4. После инкубации пробы извлекались из термостата и центрифугировались в течение 7 мин (10 тыс об/мин; MICRO 120) для осаждения оставшегося эластин-Конго красного в виде неразрушенных частиц.

5. Из надосадка брали в дублях по 150 мкл раствора и переносили в лунки 96 луночного полистиролового планшета. Планшет помещали в многоканальный спектрофотометр Ф300, где при длине волны 492 нм (максимально близкой к 495 нм) определяли оптическую плотность в лунках.

Для пересчета полученных результатов в пикокаталы нами была использована формула 2.2, выведенная после построения калибровочного графика по разведенному Конго красному, в котором была отражена зависимость активности фермента от оптической плотности раствора, исходя из того, что при расщеплении 1 молекулы субстрата, в раствор переходит 1 молекула Конго красного (рисунок 2.3). 

Y(пкат)=(0,0027+1,7* Еоп)²   

где Y – искомый результат;

Еоп – оптическая плотность пробы минус оптическая плотность контроля.

Рисунок 3 – Калибровочный график для определения эластазной активности

Качественный состав для определения эластазной активности биологических жидкостей был следующий:

а) Состав реакционной смеси для определения эластазной активности сывороток крови.

Реакционная смесь состояла из 400 мкл раствора эластин-Конго красного на  трис-HCl буфере с рН 7,4 или рН 8,8 и 100 мкл сыворотки крови.

б) Определение эластазной активности ротовой жидкости.

Реакционная смесь состояла из 400 мкл раствора  эластин-Конго красного на  трис-HCl буфере с рН 7,4 и 100 мкл ротовой жидкости.

Также была проведена разработка метода определения эластазной активности микроорганизмов.

Для определения способности микроорганизмов синтезировать эластазу производился посев культуры на среду Мюллер-Хинтона содержащую 2% желатина.

Данный субстрат был выбран из-за его доступности. При этом активировался адаптивный синтез эластазы микробами. Инкубация длилась 20 часов при температуре 37⁰С в термостате. После этого путем центрифугирования (10 минут на скорости 10 тыс об/мин) получали надосадочную жидкость, которая содержала продуцированную эластазу.

Далее постановка метода и интерпретация результатов проводилась по той же методике, как и при определении эластазной активности биологических жидкостей.

4. Методы статистического анализа

Статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета прикладных программ «Statistica 10.0», «МS Excel».

Калибровочные кривые анализировались при помощи регрессионного анализа. Эффективность диагностических методик определялась при помощи ROC-анализа с построением ROC-кривых и расчетом «отсечных» значений эластазной активности, соответствующих оптимальному сочетанию чувствительности и специфичности метода. При этом мы использовали программу для статистических расчетов MedCalc 10.2.

Результаты исследования

1. Эластазная активность биологических жидкостей

Результаты исследования эластазной активности биологических жидкостей:

а) Эластазная активность сывороток крови у пациентов с острым панкреатитом.

При оценке эластазной активности сывороток крови доноров, установлено, что её средний уровень при рН 7,4 равен 0,03±0,002 пкат, а при рН 8,8 ˗ 0,05±0,002 пкат. Средний уровень активности эластазы сывороток крови при рН 7,4 оказался достоверно выше как у группы лиц с острым панкреатитом (0,05±0,01 пкат; р=0,005), так и у группы лиц с панкреонекрозом (0,09±0,04 пкат; р=0,001) по сравнению с группой доноров.

 

Рисунок 4 – Эластазная активность сыворотки крови различных групп пациентов

При постановке опыта при рН 8,8 достоверные данные были получены только при сравнении эластазной активности между группами доноров и пациентов с панкреонекрозом (0,1±0,05 пкат; р =0,03). У пациентов с острым панкреатитом уровень эластазной активности при рН 8,8 составил 0,06±0,02 пкат, однако достоверного отличия активности данного фермента от его активности в группе доноров (рисунок 4) не обнаружено (р=0,29).

Средний уровень эластазной активности сывороток крови при рН 7,4 составил 0,06±0,02 пкат, при рН 8,8 – 0,07±0,03 пкат, однако при сравнении данной активности сывороток крови без разделения на группы достоверно подтвержденных отличий (таблица 2) обнаружено не было (р= 0,28).

 

Таблица 2 – Активность сывороточной эластазы, отражающая результаты исследований

Группы пациентов	Активность, пкат	р	Активность, пкат	Р
	рН 7,4		рН 8,8
Доноры	0,03±0,002	-	0,05±0,002	-
Панкреонекроз	0,09±0,04	0,001	0,1±0,05	0,03
Острый панкреатит	0,05±0,01	0,005	0,06±0,02	0,29
Без разделения на группы	0,06±0,02	0,28	0,07±0,03	0,28

Установлено, что сывороточная активность эластазы с оптимумом рН 7,4 различна у пациентов с острым панкреатитом (0,05±0,01 пкат) и у группы пациентов с панкреонекрозом (0,09±0,04 пкат; p=0,047).

Сывороточная активность данного фермента при рН 8,8 также имеет различия, но статистически они подтверждены не были (0,06±0,02 пкат – для пациентов с острым панкреатитом и 0,1±0,05 пкат – для пациентов с панкреонекрозом; p=0,075).

Так как уровень активности нейтрофильной эластазы в сыворотке крови достоверно повышается у пациентов с острым панкреатитом, то данный показатель можно использовать в качестве возможного диагностического критерия в постановке данного диагноза. При обработке результатов с помощью ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 7,4, при котором достигается наибольшая специфичность (77,8%) и чувствительность (84,21%) выбранного диагностического критерия – выше 0,138 пкат (рисунок 5). ДЭ была рассчитана по формуле (84,21%+77,8%)/2 и составила 81%.%. (AUC=0,830, p=0,0001).

Рисунок 5 – Вычисление порогового уровня эластазной активности для диагностики острого панкреатита при оптимуме рН 7,4

У пациентов с панкреонерозом уровень активности нейтрофильной эластазы в сыворотке крови выше, чем у пациентов без очагов некроза в поджелудочной железе. Поэтому при применении ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 7,4, при котором можно предположить наличие некроза с возможным инфицированием в поджелудочной железе – выше 0,179 пкат (рисунок 6). Специфичность методики – 100%, чувствительность – 58,71%. (AUC=0,913, p=0,0001, ДЭ=79,36%).

Рисунок 6 –Вычисление порогового уровня эластазной активности для диагностики острого панкреатита с панкреонекрозом при оптимуме рН 7,4

В то же время, учитывая тот факт, что эластаза с оптимумом рН 8,8 является абсолютно специфичным ферментом для поджелудочной железы, и ее активность в сыворотке крови достоверно повышается только при панкреонекрозе, можно использовать определение активности данного фермента подтверждения данного диагноза.

С помощью ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 8,8, при котором достигается наибольшая специфичность (100%) и чувствительность (71,43%) выбранного диагностического критерия – выше 0,243 пкат (AUC=0,762, p=0,0394, ДЭ=85,72%). Результаты изображены на рисунке 7.

Рисунок 7 –Вычисление порогового уровня эластазной активности для диагностики острого панкреатита с панкреонекрозом при оптимуме рН 8,8

б) Эластазная активность сывороток крови, полученных от пациентов с различными формами ИБС.

При оценке эластазной активности сывороток крови донорской группы оказалось, что её средний уровень был 0,083±0,019 пкат. Эластазная активность опытной группы пациентов составила 0,122±0,017 пкат, в частности при ОКС с и без подъёма сегмента ST – 0,124±0,022 пкат, при ИМ различной локализации 0,143±0,043 пкат, при стенокардии напряжения 1-3 ФК 0,120±0,017 пкат, (p=0,045).

в) Эластазная активность сывороток крови, полученных от беременных с инфекционным процессом.

В результате активность эластазы в сыворотке крови при pH 7,4 для группы доноров составила 0,049±0,027 пкат, для группы пациентов с инфекционной патологией – 0,068±0,02 пкат (p<0,05). Активность эластазы в сыворотке крови при pH 8,8 для группы пациентов с инфекционной патологией составила – 0,054±0,03 пкат. При сравнении эластазной активности сывороток крови у пациентов с инфекционной патологией было установлена, что при рН 7,4  уровень активности оказался достоверно выше, чем при рН 8,8 (p<0,05).

г) Эластазная активность ротовой жидкости.

Ативность эластазы ротовой жидкости при рН 7,4 для контрольной группы составила 0,012±0,0012 пкат, для группы пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области – 0,021±0,002 пкат (p=0,005). Достоверных отличий между группами в уровне эластазной активности при рН 8,8 выявлено не было.

2. Результаты исследования БАПНА-амидазной активности биологических жидкостей

а) БАПНА-амидазная активность сывороток крови.

В ходе исследования установлено, что у всех пациентов, имеющих диагноз острый панкреатит (с панкреонекрозом и без него) уровень сывороточной БАПНА-амидазной активности составляет 3,066±2,8 пкат, что выше, чем у доноров (1,41± 0,13 пкат; р< 0,05).

б) Связь между уровнями активности эластазы и БАПНА-амидазы в сыворотке крови у пациентов с острым панкреатитом.

Установлена статистически подтвержденная корреляционная зависимость между БАПНА-амидазной активностью и активностью эластазы сыворотки крови при рН 8,8, что указывает на схожее происхождение данных ферментов (R=0,454, p=0,022).

Достоверной корреляционной зависимости между БАПНА-амидазой и эластазой при рН 7,4 не выявлено.

3. Результаты исследования протеолитической активности микроорганизмов

а) Эластазная активность микроорганизмов.

Исследована эластазная активность 42 изолятов микроорганизмов из гнойного отделяемого пациентов с хирургическими гнойно-воспалительными заболеваниями, из которых 6 изолятов – E. coli,12 изолятов были S. aureus и 24 – P. aeruginosa .

Обнаружено, что 100% (n=24) изолятов синегнойной палочки имели эластазную активность отличную от нуля, 67% (n=9) - изоляты золотистого стафилококка и лишь 50% (n=3) изолятов кишечной палочки. В тоже время исследуемые группы достоверно не различались между собой (р>0,05) (таблица 3).

Полученные результаты подтверждают данные литературы о наличии эластазной активности у изолятов синегнойной палочки, но также впервые получены данные о наличии эластазной активности и у других видов микроорганизмов – наиболее распространенных возбудителей внутрибольничной инфекции (также как и P. aeruginosa).

 

Таблица 3 - Эластазная активность изолятов микроорганизмов

б) БАПНА-амидазная активность микроорганизмов.

Изучена БАПНА-амидазная активность микроорганизмов, выделенных у пациентов с острой и хронической хирургической инфекцией.

Наиболее высокая средняя активность (3,02+0,313 пкат) определялась у изолятов P. mirabilis. При этом 21 изолят из 24 (87,5%) изученных обладал активностью выше 1 пкат и только три изолята (12,5%) обладали активностью ниже 0,5 пкат.

Все изученные 35 изолятов P. aeruginosaобладали активностью >1 пкат (2,63+0,139 пкат). Среди 7 изученных изолятов P.vulgarisактивностью обладали все изоляты, при этом в 85,71% случаев более 1 пкат (1,647+0,282 пкат). Исследование выявило достоверно более высокую среднюю активность штаммов P. mirabilis по сравнению с P.vulgaris(р<0,05), однако анализ частот встречаемости высокоактивных штаммов не выявил достоверных различий (р>0,05) между двумя видами протея.

Среди изолятов E. coli активность выявлена у 29 изолятов из 30 обследованных (1,107+0,146 пкат), 50% из которых имели активность свыше 1 пкат. Средняя активность изолятов E. coli была достоверно ниже, чем у P.mirabilis и P. aeruginosa, но выше активности изолятов A. baumannii.

Все 5 исследованных изолятов K. pneumoniae расщепляли БАПНА с различной активностью (0,769+0,194 пкат). Из 11 изолятов A.baumannii активность была обнаружена у 7 (73,64%, 0,353+0,097 пкат), при этом изоляты с активностью выше 1 пкат не встречались. Среди 11 исследованных изолятов E. cloacae активностью обладали только 4 изолята (36,4%, 0,693+0,377 пкат).

Дополнительно к данным, приведенным в таблицах, исследована БАПНА-амидазная активность: P. сepacia(1,381 пкат; 1 изолят); M.мorganiiи K.oxytoca (исследовано по 1 изолят) БАПНА-амидазной активностью не обладали.

Из исследованных 31 изолятов  S. aureus не обладали БАПНА-амидазной активностью все исследованные культуры. БАПНА-амидазная активность не выявлена также ни у одного из 11 изолятов коагулазоотрицательных стафилококков (КОС – представлены видами S. epidermidis, S. capitis, S. sciuri).

Выводы. 1. Разработка новых методов определения протеолитической активности ферментов для изучения различных патологических процессов представляет научный и практический интерес. Модифицированный метод определения эластазной активности ферментов в биологических жидкостях и у микроорганизмов, за счет замены использования фильтров для отделения раствора от непрореагировавшего эластин-Конго красного на центрифугирование позволяет снизить себестоимость одного исследования примерно в 50 раз, что позволяет адаптировать данный метод в качестве лабораторного.

2. При помощи модифицированной нами методики определения эластазной активности биологических жидкостей установлен достоверно повышенный уровень активности нейтрофильной эластазы сыворотки крови при рН 7,4 у пациентов с острым панкреатитом и с панкреонекрозом (0,09±0,04 пкат (р=0,001), 0,05±0,01 пкат (р=0,005) соответственно в сравнении с группой доноров – 0,03±0,002 пкат). Учитывая, что панкреатическая эластазная активность достоверно повышается при рН 8,8 только при панкреонекрозе (0,1±0,05 пкат (р=0,03) по сравнению с группой доноров 0,05±0,002 пкат), определение эластазной активности может иметь диагностическое значение при дифференциальной диагностике данной патологии.

3. Были определены возможные диагностические критерии для постановки диагноза острый панкреатит с панкреонекрозом и без него. При обработке результатов с помощью ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 7,4, при котором достигается наибольшая специфичность (77,8%) и чувствительность (84,21%) выбранного диагностического критерия – выше 0,138 пкат. (AUC=0,830, p=0,0001). При применении ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 7,4, при котором можно предположить наличие некроза с возможным инфицированием в поджелудочной железе – выше 0,179 пкат. Специфичность методики – 100%, чувствительность – 58,71%, (AUC=0,913, p=0,0001).

4. Также с помощью ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 8,8, при котором достигается наибольшая специфичность (100%) и чувствительность (71,43%) выбранного диагностического критерия – выше 0,243 пкат, (AUC=0,762, p=0,0394).

5. Была определена ферментативная (протеолитическая) активность  42 изолятов микроорганизмов. В частности было установлено, что преимущественно изоляты P. aeruginosa (все 23 изолята) обладают эластазной активностью, а также данной активностью обладают и другие виды микроорганизмов, например возбудители внутрибольничных инфекций – S aureus и E.coli. Была определена БАПНА-амидазная активность 167 изолятов микроорганизмов и выявлено, что изоляты S. aureus (n=42) не обладают такой ферментативной активностью. Данная информация может быть использована для определения степени патогенности и идентификации изолятов микроорганизмов, а также корректировки антибактериальной и иммуностимулирующей терапии пациентов с хирургическими гнойно-воспалительными заболеваниями.

6. Выявлено достоверное повышение уровня эластазной активности сывороток крови у беременных женщин с инфекционной патологией, причем при рН 7,4 уровень данной активности был достоверно выше (0,068±0,02 пкат, р<0,05) , чем при рН 8,8 (0,054±0,03 пкат) что, вероятно, является результатом увеличения количества нейтрофилов в крови при присоединении инфекции. Схожие результаты были получены и при сравнении пациентов с гнойно-воспалительной патологией челюстно-лицевой области с группой доноров (0,021±0,002 пкат; 0,012 пкат±0,0012 пкат соответственно, р=0,0005), т.е. можно заключить, что значительной повышение активности нейтрофильной эластазы – это возможный маркер воспалительного процесса.

7. Определено, что эластазная активность сыворотки крови у пациентов с различными формами ИБС была достоверно выше чем у группы доноров (0,122±0,017 пкат, 0,083±0,019 пкат соответственно, р=0,045), что свидетельствует о процессах повреждения и развитии воспалительной реакции как на компоненты разрушенных клеток, так и на компоненты соединительной ткани (в частности эластина) у данных пациентов.

1. Australian Protease Network [Электронный ресурс] – Режим доступа :www. medbibl. ru. – Дата доступа : 15.05.2012.
2. Carroccio, A. [et al.] Usefulness of faecal elastase-1 assay in monitoring pancreatic function in childhood coeliac disease. / A. Carroccio; G. Iacono; S. Ippolito; F. Verghi // Italian Journal Of Gastroenterology And Hepatology. – 1998. – Vol. 30 (5). – P. 500-504.
3. Bairoch, A. The ENZYME databasein 2000 / A.Bairoch // Nucleic Acids Res. – 2000. – Vol. 28, N 1. – P. 304–305.
4. Paczek, L. Trypsin, elastase, plasmin andMMP-9 activity in the serum during the human ageing process / L. Paczek, W. Michalska, I. Bartlomiejczyii // Age. Ageing. – 2008 May. –Vol. 37, N 3. – P. 318–323.
5. Vine, N. Metalloproteinases in degenerative aortic disease / N. Vine, J.T. Powell // Clin. Sci (Lond). – 1991. – Vol. 81, N 2. – P. 233–239.
6. Xu, Y [et al. ] Pancreatic exocrine function and morphology following an episode of acute pancreatitis./ Y Xu; D Wu; Y Zeng; X Wang // Journal Pancreas. – 2012. – Vol. 41 (6), P. 922-927.
7. Rice, W.G., Weiss S.J. Regulation of proteolysis at the neutrophil substrate interface by secretory leukoprotease inhibitor / G.W. Rice, S.J. Weiss // Science. – 1990. – Vol. 249. – P. 178–181.
8. Neutrophil extracellular traps kill bacteria / Brinkmann V. [et al.] // Science — 2004. — Vol. 303, N 5663. — P.1532–1535.
9. Boudier, C., Bieth J.G. Oxidized mucus proteinase inhibitor: a fairly potent neutrophil elastase inhibitor / C. Boudier, J. G. Bieth // CBiochem. J. – 1994. – Vol. 303. – P. 61–68.
10. Inhibition of human leukocyte elastase bound to elastin: relative ineffectiveness and two mechanisms of inhibitory activity / H.M. Morrison // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. – 1990. – Vol. 2. – P. 263–269.
11. Saunders, W.B., Bayless K.J., Davis G.E. MMP–1 activation by serine proteases and MMP– 10 induces human capillary tubular network collapse and regression in 3D collagen matrices / W.B. Saunders, K.J. Bayless, G.E. Davis // J. Cell. Sci. – 2005. – Vol. 118 (pt 10). – P. 2325–2340.
12. Shapiro, S.D., Senior R.M. Matrix metalloproteinases. Matrix degradation and more / S.D. Shapiro, R.M. Senior // Am. J. Respir. CellMol. Biol. – 1999. – Vol. 20. – P. 1100–1102.
13. Аверьянов, А.В. Роль нейтрофильной эластазы в патогенезе хронической обструктивной болезни лёгких / А. В. Аверьянов // Цитокины и воспаление. – 2007. –Т. 6, № 4. – С. 3–8.
14. Супотницкий, М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии / М. В. Супотницкий. – Москва: Вузовская книга, 2000. – 376 с.
15. Morihara K., Tsuzuki H, Production of protease and elastase by Pseudomonas aeruginosa strains isolated from patients. / K. Morihara, H. Tsuzuki // Infection and immunity. – 1977. – Vol 15(3). – P. – 679–685.
16. Окулич, В.К. Методика определения активности эластазы в биологических жидкостях / В.К. Окулич, Д.Г. Сосинович, А.В. Корнилов, Ю.Г. Савкина, С.А. Сенькович // инструкция на метод, регистрационный №66 – 2011 г.
17. Окулич, В.К. / Метод определения эластазной активности микроорганизмов / В.К. Окулич, А.В. Корнилов, Ю.Г. Савкина, А.Р. Прудников // инструкция на метод регистрационный №3 -2013 г.

Рецензии:

16.08.2016, 11:53 Ташпулатова Фатима Кудратовна
Рецензия: Рецензия на статью Прудникова Александра Руслановича «Ферментативная протеолитическая активность, которая определяется в биологических объектах» Статья посвящена актуальной теме- изучению протеолитической ферментативной активности биологических жидкостей и микроорганизмов у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями и различными формами ИБС. Цель и задачи поставлены в соответствии изучаемой проблеме. Методы исследования современны и что очень важно доступны в практическом здравоохранении. Особо необходимо отметить, что в ходе проведенных исследований модифицирован метод определения эластазной активности биологических жидкостей и микроорганизмов. Автором на основе полученных данных предложены диагностические критерии острого панкреатита с панкреонекрозом или без него по уровню эластазной активности сыворотки крови. В работе получены результаты, которые указывают о необходимости проведения более глубоких научных исследований в этой области. Полученные данные обработаны статистическими методами, приведены достоверность разницы между группами сравнения. Статья иллюстрирована таблицами и рисунками, которые наглядно отражают суть работы. Выводы логически вытекают из результатов представленных в статье. Заключение. Статью Прудникова Александра Руслановича «Ферментативная протеолитическая активность, которая определяется в биологических объектах» рекомендую к публикации. Заведующая кафедрой фтизиатрии Ташкентского педиатрического медицинского института, д.м.н, доцент Ташпулатова Ф.К.



Комментарии пользователей:

Оставить комментарий