Публикация научных статей.
Вход на сайт
E-mail:
Пароль:
Запомнить
Регистрация/
Забыли пароль?
Международный научно-исследовательский журнал публикации ВАК
Научные направления
Поделиться:
Статья опубликована в №36 (август) 2016
Разделы: Медицина
Размещена 13.08.2016. Последняя правка: 21.08.2016.

Ферментативная протеолитическая активность, которая определяется в биологических объектах

Прудников Александр Русланович

магистр медицинских наук

УО "Витебский госудаственный медицинский университет"

преподаватель-стажер

Щупакова Алина Николаевна, доктор медицинских наук, профессор кафедры внутренних болезней №1 УО Витебский государственный медицинский университет, Окулич Виталий Константинович кандидат медицинских наук, доцент кафедры клинической микробиологии УО Витебский государственный медицинский университет


Аннотация:
Объектом исследования являются биологические жидкости (сыворотка крови, ротовая жидкость) и выделенные микроорганизмы от пациентов с различными гнойно-воспалительными заболеваниями (остеомиелит, флегмоны и абсцессы различных клетчаточных пространств) и различными формами ИБС. Цель исследования – определить протеолитическую ферментативную активность биологических жидкостей и микроорганизмов у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями и различными формами ИБС. В ходе проведенных исследований модифицирован метод определения эластазной активности биологических жидкостей и микроорганизмов. Определены эластазная, БАПНА-амидазная активности в биологических жидкостях (сыворотка крови, ротовая жидкость) и у микроорганизмов. На основе полученных данных предложены диагностические критерии острого панкреатита с панкреонекрозом или без него по уровню эластазной активности сыворотки крови.


Abstract:
Various biological fluids (blood serum, oral liquid) and microorganisms from patients with different pathologies were the main objects of the research. The aim of the study was to determine the proteolytic enzymatic activity of biological fluids and microorganisms in patients with different purulent-inflammatory diseases (osteomyelitis, cellulitis and abscesses of different cellular spaces) and various forms of coronary artery disease. Throughout the research, the method of determining elastase of enzyme activity in biological fluids and microorganisms was developed. Both the elastase and BAPNA-amidase activities in biological fluids (serum, oral fluid) and microorganisms were determined. Based on the levels of serum elastase activity, the diagnostic criteria of acute pancreatitis with pancreatic necrosis or without the latter were proposed.


Ключевые слова:
эластаза; БАПНА-амидаза; протеолитическая активность.

Keywords:
proteolytic activity; elastase; BAPNA-amidase.


УДК 616-01/-099

Актуальность. Протеазы играют ключевую регуляторную функцию в процессах оплодотворения, родов, пищеварения, роста, а также в процессах созревания, старения и смерти всех клеток. Они регулируют практически все физиологические процессы, управляя активацией, синтезом и деградацией белков как высших, так и низших организмов. Протеазы играют важную роль в жизнедеятельности вирусов, бактерий и паразитов, облегчая их инвазию и распространение внутри макроорганизма, а также эффективное размножение, обеспечивая защиту от барьерных сил и системы иммунитета макроорганизма [1].

В последние десятилетия множество научных разработок посвящено изучению фермента эластазы [2]. Эластаза – это эндопептидаза, которая разрушает нерастворимые матриксные белки, в том числе и эластин, как в норме (например, в процессе обновления внеклеточного матрикса), так и при различных формах патологии. Существует также множество ферментов, обладающих эластазной активностью либо непосредственно определяемые как разновидность данной пептидазы (приведем некоторые примеры): три сериновые протеиназы (нейтрофильная эластаза-2, катепсин G, протеиназа-3), четыре металлопротеиназы (желатиназа А и Б, матрилизин, макрофагальная эластаза-12) и четыре цистеиновые протеиназы (катепсины L, S, K, V). У млекопитающих эластаза вырабатывается главным образом в поджелудочной железе и в фагоцитах [3]. Среди низших организмов данный фермент вырабатывается лишь некоторыми видами микроорганизмов (например, синегнойной палочкой) [3].

Различные виды эластазы участвуют в физиологических процессах: в расщеплении внеклеточного матрикса, при переваривании пищи (панкреатический тип), при обновлении соединительной ткани и уничтожении микроорганизмов (макрофагальный и нейтрофильный типы), но также играют важную роль в патогенезе муковисцидоза, эмифиземы легких и других форм патологий, сопровождающихся воспалением [4,5].

В сыворотку крови панкреатическая эластаза-1 попадает только из поджелудочной железы, поэтому определение фермента является важным для диагностики заболеваний этой железы. В крови здоровых людей активность панкреатической эластазы-1 почти не определяется или очень низкая. Панкреатическая эластаза-1 играет важную роль в патогенезе острого панкреатита. Её активность повышается в первые 48 ч после начала приступа острого панкреатита почти у 100 % пациентов, а затем постепенно снижается. Активность эластазы-1 повышается в крови при остром и обострении  хронического панкреатита раньше, чем уровень других ферментов, еще на субклинической стадии [6]. Т.к. период полураспада панкреатической эластазы-1 дольше, чем амилазы и липазы, то и период выявления повышенной её активности в крови длиннее [6]. Это означает, что данный фермент может использоваться как потенциальный маркер развития острого и обострения хронического панкреатита.

Лейкоцитарную (макрофагальную и нейтрофильную) эластазу считают маркером хронических и острых воспалительных заболеваний, который отражает степень дегрануляции и активации нейтрофильных лейкоцитов и макрофагов. Активность лейкоцитарной эластазы оценивается при комплексной диагностике синдрома полиорганной недостаточности, а также заболеваний, сопровождающихся выраженным, плохо контролируемым воспалением [4,5].

Выделение эластазы из нейтрофилов в экстрацеллюлярное пространство происходит под влиянием различных субстанций: цитокинов (ФНО-α, ИЛ-8), липополисахарида, фрагментов бактериальной стенки. Инактивация НЭ осуществляется преимущественно α1-антитрипсином и частично β2-макроглобулином, а также менее изученными секреторным лейкоцитарным протеазным ингибитором, элафином и эглином С, относящимися к семейству серпинов. Несмотря на значительные резервы ингибиторов протеаз (кроме случаев дефицита α1-антитрипсина), имеющиеся в любом организме, существуют механизмы, помогающие нейтрофилам реализовать свой деструктивный потенциал. Во-первых, нейтрофилы выделяют оксиданты, окисляющие активный центр антитрипсина, делая его функционально неактивным [9]. Во-вторых, связавшись с эластином экстрацеллюлярного матрикса, НЭ становиться неуязвимой для серпинов [10]. Избыточная продукция НЭ либо невозможность ее адекватного ингибирования наблюдается при целом ряде заболеваний, из которых наиболее значимыми являются эмфизема легких и муковисцидоз [4].

Наиболее изучена роль НЭ в механизмах развития эмфиземы легких как результата расщепления эластина экстрацеллюлярного матрикса легочной паренхимы. В деградацию альвеолярных стенок при эмфиземе, помимо НЭ, вовлечены и другие группы протеаз, прежде всего, матриксные металлопротеиназы, являющиеся продуктом нейтрофилов (ММП-8, ММП-9) и макрофагов (ММП-1, 2, 3, 7, 9, 12). Однако, в отличие от сериновых протеаз, ММП выделяются в межклеточное пространство в неактивной форме. Для реализации своего протеолитического потенциала данные протеазы должны быть активированы, и одним из индукторов их активности выступает НЭ [11]. В свою очередь, ММП подавляют активность антитрипсина, предохраняя, таким образом, НЭ от инактивации [12]. Следовательно, помимо прямого эластазного эффекта, НЭ опосредованно влияет и на деструкцию других компонентов ЭЦМ — коллагена и желатина металлопротеиназами.

Синтезировать эластазу так же могут и микроорганизмы. Выделяясь в окружающую среду, микробная эластаза играет роль фактора агрессии и инвазии и помогает микроорганизмам преодолевать защитные барьеры макроорганизма, она расщепляет крупные молекулы до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки, таким образом, обеспечивая бактерии субстратами для образования энергии и полимеров [13,14].

Однако, по данным литературы, не все микроорганизмы способны синтезировать эластазу, а только некоторые изоляты синегнойной палочки. [15].

Рассматривая роль различных видов эластаз (панкреатической, нетрофильной, бактериальной) в патогенезе многочисленных заболеваний, можно сделать вывод, что разработка новых методов определения протеолитической активности ферментов, в биологических жидкостях, у микроорганизмов и изучение изменения данной активности при различных патологических процессах представляет научный и практический интерес для разработки новых методов диагностики и лечения.

Материалы и методы исследования.

1. Получение биологических материалов

Было получено информированное добровольное согласие пациентов на получение от них биологических жидкостей для проведения исследований.

Биологический материал для проведения исследования включает:

а) Получение сывороток крови.

Кровь забиралась натощак с 8 до 9 часов утра из локтевой вены, центрифугировалась со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 10 минут; сыворотка отбиралась, замораживалась и хранилась при –250 С.

Была исследована протеолитическая активность сыворотки крови у 9 (26%) доноров и 26 пациентов с острым панкреатитом, 19 (54%) из которых имели диагноз острый панкреатит без панкреонекроза, а 7 (20%) пациентов имели очаги некроза в поджелудочной железе.

Также исследовали протеолитическую активность сыворотки у 35 пациентов с различными формами ИБС (ИБС: стабильная стенокардия напряжения 1-3 ФК (n=18); инфаркт миокарда различной локализации (n=5); ОКС с подъёмом и без подъёма ST (n=7) и др.) и 25 практически здоровых доноров из УЗ «ВОСПК».

Исследовали протеолитическую активность сывороток крови у 23 беременных женщин с инфекционной патологией. Забор сыворотки крови брали у пациентов, находившихся на лечении на базе УЗ «БСМП», кардиологического отделения УЗ «ВОКБ» и родильного дома № 3 города Витебска соответственно.

б) Получение препаратов ротовой жидкости.

Для определения эластазной активности забор ротовой жидкости производили на базе отделения челюстно-лицевой хирургии ВОКБ (20 образцов ротовой жидкости больных с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области) и у студентов без гнойно-воспалительной патологии ротовой полости (n=22).

в) Выделение изолятов микроорганизмов.

Исследована эластазная активность 42 изолятов микроорганизмов, из которых 6 изолятов – E. coli, 12 изолятов были S. aureus и 24 – P.aeruginosa. Изоляты микроорганизмов были получены из гнойного отделяемого ран у пациентов, находившихся на лечении в ожоговом, гнойном хирургическом отделениях и РАО на базе УЗ «ВОКБ».

Мы исследовали частоту встречаемости и уровень БАПНА-амидазной активности у основных видов возбудителей хирургической инфекции. Нами была определена БАПНА-амидазная активностьу 167 изолятов микроорганизмов, выделенных от хирургических пациентов с гнойно-воспалительными процессами (таблица 1).

Таблица 1 – Изоляты микроорганизмов, у которых исследовалась БАПНА-амидазная активность

Изоляты

n

S. aureus

31

КОС

11

P. aeruginosa

35

P. mirabilis

24

E. coli

30

P. vulgaris

7

E. cloacae

11

A. baumannii

11

K. pneumoniae

5

Идентификация микроорганизмов проводилась с помощью тест-систем на автоматизированном биохимическом анализаторе АТВ Expression фирмы «bioMerieux».

2. Определение БАПНА-амидазной активности биологических материалов

Определение БАПНА-амидазной активности было сделано в несколько этапов:

а) Постановка реакции для определения БАПНА-амидазной активности сывороток крови.

Для определения БАПНА-амидазной активности сывороток в качестве субстрата протеолиза использовали бензоиларгинин-р-нитроанилид. Выбор субстрата обусловлен тем, что распад БАПНА происходит только в результате расщепления амидной (аналога пептидной) связи по аминокислотам Arg-Lis. В лунки плоскодонного стерильного планшета для ИФА вносилось 0,2 мл раствора БАПНА (24 мг БАПНА растворяется в 0,9 мл диметилсульфоксида и доводится до 30 мл 0,05М трис-NaOH буфером-рН 7,4) и 0,005 мл исследуемой сыворотки. Учет результатов реакции осуществлялся после 20-ти часовой инкубации при температуре 37,6° С на анализаторе иммуноферментном фотоэлектрическом при длине волны 410 нм. Для пересчета полученного результата в пикокаталы нами была использована формула, а также калибровочный график (рисунок 1): 

Y = 0,028+11ЧEоп   

где Y – искомый результат;

Еоп  - оптическая плотность пробы минус оптическая плотность контроля.

Рисунок 1 - Калибровочный график для определения БАПНА-амидазной активности

б) Постановка реакции для определения БАПНА-амидазной активности амниотической жидкости.

Реакционная смесь состояла из 0,2 мл раствора БАПНА (24 мг БАПНА растворяется в 0,9 мл диметилсульфоксида и доводится до 30 мл 0,05М трис-NaOH буфером-рН7,4) и 0,005 мл исследуемой амниотической жидкости.

в) Постановка реакции для определения БАПНА-амидазной активности микроорганизмов.

Для исследований использовали суточную чистую культуру микроорганизмов, выращенных на мясопептонном агаре. На физиологическом растворе готовили взвесь микроорганизмов в концентрации 109 на 1 мл, что соответствует оптической плотности 0,83 единиц экстинции при длине волны 550 нм и оптическом пути 1 см при измерении на спектрофотометре, или 3,3 ЕД МcFarland при измерении на денситометре, или 10 ЕД стандарта Центрального государственного научного контрольного института имени Тарасевича (Россия).

Далее в лунку планшета для иммуноферментного анализа вносили по 0,1 мл исследуемой взвеси бактерий и 0,1 мл раствора БАПНА. Для улучшения воспроизводимости метода, учитывая коэффициент внутрианализной вариации 3,7%, определение активности производили в триплетах. В качестве отрицательного контроля использовали 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл раствора БАПНА, положительного контроля - стандартный штамм микроорганизма с заведомо положительной активностью, например P. aeruginosaATCC 27853 или 0,01% раствор р-нитроанилида.

3. Метод определения эластазной активности в биологических жидкостях

Нами была модифицирована методика определения эластазной активности в биологических жидкостях [16,17].

В качестве субстрата в данной методике выступает эластин-Конго красный (диаметр частиц 37-75 микрон). При взаимодействии с эластазой, последняя разрушает эластин, и конго-Красный переходит в раствор, изменяя его цвет с прозрачного на красный с максимальным спектром поглощения 495 нм (рисунок 2).

Однако данная методика обладает рядом недостатков:

1. Потребность в дорогостоящих фильтрах c диаметром пор 0,8 µм, которые были предназначены для отделения раствора от непрореагировавшего эластин-Конго красного.

2. Использование пробирок. При работе с малыми объемами жидкости это доставляет ряд неудобств.

3. Данная методика не позволяет изучать эластазную активность микроорганизмов.

 

Рисунок 2 – Снимок частиц эластазы до и после инкубации, полученный на конфокальном микроскопе LeicaTCSSPE

Суть модификации методики для определения эластазной активности биологических жидкостей заключалась в замене дорогостоящих фильтров на центрифугирование и использование вместо пробирок эппендорфов.

Постановка метода:

1. Биологическая жидкость перед применением центрифугировалась 1,5 тыс. об/мин в течение 10 мин.

2. Реакционная смесь в опытных пробах состояла из 400 мкл раствора эластин-Конго красного в концентрации 0,8 мг на 1 мл трис-НСl буферного раствора с требуемым рН (показатель зависит от типа фермента) и 100 мкл исследуемой биологической жидкости (опытным путем было установлено, что наилучший результат получается при использовании данного объема). В контрольные пробах вместо биологической жидкости вносился буферный раствор с соответствующим рН.

3. Компоненты реакционной смеси последовательно вносились в эппендорфы, и инкубация проб проводилась в термостате при Т=37°С в течение 24 часов.

4. После инкубации пробы извлекались из термостата и центрифугировались в течение 7 мин (10 тыс об/мин; MICRO 120) для осаждения оставшегося эластин-Конго красного в виде неразрушенных частиц.

5. Из надосадка брали в дублях по 150 мкл раствора и переносили в лунки 96 луночного полистиролового планшета. Планшет помещали в многоканальный спектрофотометр Ф300, где при длине волны 492 нм (максимально близкой к 495 нм) определяли оптическую плотность в лунках.

Для пересчета полученных результатов в пикокаталы нами была использована формула 2.2, выведенная после построения калибровочного графика по разведенному Конго красному, в котором была отражена зависимость активности фермента от оптической плотности раствора, исходя из того, что при расщеплении 1 молекулы субстрата, в раствор переходит 1 молекула Конго красного (рисунок 2.3). 

Y(пкат)=(0,0027+1,7* Еоп)2   

где Y – искомый результат;

Еоп – оптическая плотность пробы минус оптическая плотность контроля.

Рисунок 3 – Калибровочный график для определения эластазной активности

Рисунок 3 Калибровочный график для определения эластазной активности

Качественный состав для определения эластазной активности биологических жидкостей был следующий:

а) Состав реакционной смеси для определения эластазной активности сывороток крови.

Реакционная смесь состояла из 400 мкл раствора эластин-Конго красного на  трис-HCl буфере с рН 7,4 или рН 8,8 и 100 мкл сыворотки крови.

б) Определение эластазной активности ротовой жидкости.

Реакционная смесь состояла из 400 мкл раствора  эластин-Конго красного на  трис-HCl буфере с рН 7,4 и 100 мкл ротовой жидкости.

Также была проведена разработка метода определения эластазной активности микроорганизмов.

Для определения способности микроорганизмов синтезировать эластазу производился посев культуры на среду Мюллер-Хинтона содержащую 2% желатина.

Данный субстрат был выбран из-за его доступности. При этом активировался адаптивный синтез эластазы микробами. Инкубация длилась 20 часов при температуре 370С в термостате. После этого путем центрифугирования (10 минут на скорости 10 тыс об/мин) получали надосадочную жидкость, которая содержала продуцированную эластазу.

Далее постановка метода и интерпретация результатов проводилась по той же методике, как и при определении эластазной активности биологических жидкостей.

4. Методы статистического анализа

Статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета прикладных программ «Statistica 10.0», «МS Excel».

Калибровочные кривые анализировались при помощи регрессионного анализа. Эффективность диагностических методик определялась при помощи ROC-анализа с построением ROC-кривых и расчетом «отсечных» значений эластазной активности, соответствующих оптимальному сочетанию чувствительности и специфичности метода. При этом мы использовали программу для статистических расчетов MedCalc 10.2.

Результаты исследования

1. Эластазная активность биологических жидкостей

Результаты исследования эластазной активности биологических жидкостей:

а) Эластазная активность сывороток крови у пациентов с острым панкреатитом.

При оценке эластазной активности сывороток крови доноров, установлено, что её средний уровень при рН 7,4 равен 0,03±0,002 пкат, а при рН 8,8 ˗ 0,05±0,002 пкат. Средний уровень активности эластазы сывороток крови при рН 7,4 оказался достоверно выше как у группы лиц с острым панкреатитом (0,05±0,01 пкат; р=0,005), так и у группы лиц с панкреонекрозом (0,09±0,04 пкат; р=0,001) по сравнению с группой доноров.

 Рисунок 4 – Эластазная активность сыворотки крови различных групп пациентов

Рисунок 4 Эластазная активность сыворотки крови различных групп пациентов

При постановке опыта при рН 8,8 достоверные данные были получены только при сравнении эластазной активности между группами доноров и пациентов с панкреонекрозом (0,1±0,05 пкат; р =0,03). У пациентов с острым панкреатитом уровень эластазной активности при рН 8,8 составил 0,06±0,02 пкат, однако достоверного отличия активности данного фермента от его активности в группе доноров (рисунок 4) не обнаружено (р=0,29).

Средний уровень эластазной активности сывороток крови при рН 7,4 составил 0,06±0,02 пкат, при рН 8,8 – 0,07±0,03 пкат, однако при сравнении данной активности сывороток крови без разделения на группы достоверно подтвержденных отличий (таблица 2) обнаружено не было (р= 0,28).

 

Таблица 2 Активность сывороточной эластазы, отражающая результаты исследований

Группы пациентов

Активность, пкат

 

р

Активность, пкат

 

Р

рН 7,4

рН 8,8

Доноры

0,03±0,002

-

0,05±0,002

-

Панкреонекроз

0,09±0,04

0,001

0,1±0,05

0,03

Острый панкреатит

0,05±0,01

0,005

0,06±0,02

0,29

Без разделения на группы

0,06±0,02

0,28

0,07±0,03

0,28

Установлено, что сывороточная активность эластазы с оптимумом рН 7,4 различна у пациентов с острым панкреатитом (0,05±0,01 пкат) и у группы пациентов с панкреонекрозом (0,09±0,04 пкат; p=0,047).

Сывороточная активность данного фермента при рН 8,8 также имеет различия, но статистически они подтверждены не были (0,06±0,02 пкат – для пациентов с острым панкреатитом и 0,1±0,05 пкат – для пациентов с панкреонекрозом; p=0,075).

Так как уровень активности нейтрофильной эластазы в сыворотке крови достоверно повышается у пациентов с острым панкреатитом, то данный показатель можно использовать в качестве возможного диагностического критерия в постановке данного диагноза. При обработке результатов с помощью ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 7,4, при котором достигается наибольшая специфичность (77,8%) и чувствительность (84,21%) выбранного диагностического критерия – выше 0,138 пкат (рисунок 5). ДЭ была рассчитана по формуле (84,21%+77,8%)/2 и составила 81%.%. (AUC=0,830, p=0,0001).

Рисунок 5 – Вычисление порогового уровня эластазной активности для диагностики острого панкреатита при оптимуме рН 7,4

Рисунок 5 Вычисление порогового уровня эластазной активности для диагностики острого панкреатита при оптимуме рН 7,4

У пациентов с панкреонерозом уровень активности нейтрофильной эластазы в сыворотке крови выше, чем у пациентов без очагов некроза в поджелудочной железе. Поэтому при применении ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 7,4, при котором можно предположить наличие некроза с возможным инфицированием в поджелудочной железе – выше 0,179 пкат (рисунок 6). Специфичность методики – 100%, чувствительность – 58,71%. (AUC=0,913, p=0,0001, ДЭ=79,36%).

Рисунок 6 –Вычисление порогового уровня эластазной активности для диагностики острого панкреатита с панкреонекрозом при оптимуме рН 7,4

Рисунок 6 Вычисление порогового уровня эластазной активности для диагностики острого панкреатита с панкреонекрозом при оптимуме рН 7,4

В то же время, учитывая тот факт, что эластаза с оптимумом рН 8,8 является абсолютно специфичным ферментом для поджелудочной железы, и ее активность в сыворотке крови достоверно повышается только при панкреонекрозе, можно использовать определение активности данного фермента подтверждения данного диагноза.

С помощью ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 8,8, при котором достигается наибольшая специфичность (100%) и чувствительность (71,43%) выбранного диагностического критерия – выше 0,243 пкат (AUC=0,762, p=0,0394, ДЭ=85,72%). Результаты изображены на рисунке 7.

Рисунок 7 –Вычисление порогового уровня эластазной активности для диагностики острого панкреатита с панкреонекрозом при оптимуме рН 8,8

Рисунок 7 Вычисление порогового уровня эластазной активности для диагностики острого панкреатита с панкреонекрозом при оптимуме рН 8,8

б) Эластазная активность сывороток крови, полученных от пациентов с различными формами ИБС.

При оценке эластазной активности сывороток крови донорской группы оказалось, что её средний уровень был 0,083±0,019 пкат. Эластазная активность опытной группы пациентов составила 0,122±0,017 пкат, в частности при ОКС с и без подъёма сегмента ST – 0,124±0,022 пкат, при ИМ различной локализации 0,143±0,043 пкат, при стенокардии напряжения 1-3 ФК 0,120±0,017 пкат, (p=0,045).

в) Эластазная активность сывороток крови, полученных от беременных с инфекционным процессом.

В результате активность эластазы в сыворотке крови при pH 7,4 для группы доноров составила 0,049±0,027 пкат, для группы пациентов с инфекционной патологией – 0,068±0,02 пкат (p<0,05). Активность эластазы в сыворотке крови при pH 8,8 для группы пациентов с инфекционной патологией составила – 0,054±0,03 пкат. При сравнении эластазной активности сывороток крови у пациентов с инфекционной патологией было установлена, что при рН 7,4  уровень активности оказался достоверно выше, чем при рН 8,8 (p<0,05).

г) Эластазная активность ротовой жидкости.

Ативность эластазы ротовой жидкости при рН 7,4 для контрольной группы составила 0,012±0,0012 пкат, для группы пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области – 0,021±0,002 пкат (p=0,005). Достоверных отличий между группами в уровне эластазной активности при рН 8,8 выявлено не было.

2. Результаты исследования БАПНА-амидазной активности биологических жидкостей

а) БАПНА-амидазная активность сывороток крови.

В ходе исследования установлено, что у всех пациентов, имеющих диагноз острый панкреатит (с панкреонекрозом и без него) уровень сывороточной БАПНА-амидазной активности составляет 3,066±2,8 пкат, что выше, чем у доноров (1,41± 0,13 пкат; р< 0,05).

б) Связь между уровнями активности эластазы и БАПНА-амидазы в сыворотке крови у пациентов с острым панкреатитом.

Установлена статистически подтвержденная корреляционная зависимость между БАПНА-амидазной активностью и активностью эластазы сыворотки крови при рН 8,8, что указывает на схожее происхождение данных ферментов (R=0,454, p=0,022).

Достоверной корреляционной зависимости между БАПНА-амидазой и эластазой при рН 7,4 не выявлено.

3. Результаты исследования протеолитической активности микроорганизмов

а) Эластазная активность микроорганизмов.

Исследована эластазная активность 42 изолятов микроорганизмов из гнойного отделяемого пациентов с хирургическими гнойно-воспалительными заболеваниями, из которых 6 изолятов – E. coli,12 изолятов были S. aureus и 24 – P. aeruginosa .

Обнаружено, что 100% (n=24) изолятов синегнойной палочки имели эластазную активность отличную от нуля, 67% (n=9) - изоляты золотистого стафилококка и лишь 50% (n=3) изолятов кишечной палочки. В тоже время исследуемые группы достоверно не различались между собой (р>0,05) (таблица 3).

Полученные результаты подтверждают данные литературы о наличии эластазной активности у изолятов синегнойной палочки, но также впервые получены данные о наличии эластазной активности и у других видов микроорганизмов – наиболее распространенных возбудителей внутрибольничной инфекции (также как и P. aeruginosa).

 

Таблица 3 - Эластазная активность изолятов микроорганизмов

Значения активности (в

пикокаталлах) / Изоляты

P. aeruginosa(n=24)

S. aureus(n=12)

E .coli

(n=6)

Минимум

0,003

0

0

Среднее

0,032

0,024

0,0003

Медиана

0,031

0,026

0,00036

Максимум

0,091

0,068

0,009

б) БАПНА-амидазная активность микроорганизмов.

Изучена БАПНА-амидазная активность микроорганизмов, выделенных у пациентов с острой и хронической хирургической инфекцией.

Наиболее высокая средняя активность (3,02+0,313 пкат) определялась у изолятов P. mirabilis. При этом 21 изолят из 24 (87,5%) изученных обладал активностью выше 1 пкат и только три изолята (12,5%) обладали активностью ниже 0,5 пкат.

Все изученные 35 изолятов P. aeruginosaобладали активностью >1 пкат (2,63+0,139 пкат). Среди 7 изученных изолятов P.vulgarisактивностью обладали все изоляты, при этом в 85,71% случаев более 1 пкат (1,647+0,282 пкат). Исследование выявило достоверно более высокую среднюю активность штаммов P. mirabilis по сравнению с P.vulgaris(р<0,05), однако анализ частот встречаемости высокоактивных штаммов не выявил достоверных различий (р>0,05) между двумя видами протея.

Среди изолятов E. coli активность выявлена у 29 изолятов из 30 обследованных (1,107+0,146 пкат), 50% из которых имели активность свыше 1 пкат. Средняя активность изолятов E. coli была достоверно ниже, чем у P.mirabilis и P. aeruginosa, но выше активности изолятов A. baumannii.

Все 5 исследованных изолятов K. pneumoniae расщепляли БАПНА с различной активностью (0,769+0,194 пкат). Из 11 изолятов A.baumannii активность была обнаружена у 7 (73,64%, 0,353+0,097 пкат), при этом изоляты с активностью выше 1 пкат не встречались. Среди 11 исследованных изолятов E. cloacae активностью обладали только 4 изолята (36,4%, 0,693+0,377 пкат).

Дополнительно к данным, приведенным в таблицах, исследована БАПНА-амидазная активность: P. сepacia(1,381 пкат; 1 изолят); M.мorganiiи K.oxytoca (исследовано по 1 изолят) БАПНА-амидазной активностью не обладали.

Из исследованных 31 изолятов  S. aureus не обладали БАПНА-амидазной активностью все исследованные культуры. БАПНА-амидазная активность не выявлена также ни у одного из 11 изолятов коагулазоотрицательных стафилококков (КОС – представлены видами S. epidermidis, S. capitis, S. sciuri).

Выводы. 1. Разработка новых методов определения протеолитической активности ферментов для изучения различных патологических процессов представляет научный и практический интерес. Модифицированный метод определения эластазной активности ферментов в биологических жидкостях и у микроорганизмов, за счет замены использования фильтров для отделения раствора от непрореагировавшего эластин-Конго красного на центрифугирование позволяет снизить себестоимость одного исследования примерно в 50 раз, что позволяет адаптировать данный метод в качестве лабораторного.

2. При помощи модифицированной нами методики определения эластазной активности биологических жидкостей установлен достоверно повышенный уровень активности нейтрофильной эластазы сыворотки крови при рН 7,4 у пациентов с острым панкреатитом и с панкреонекрозом (0,09±0,04 пкат (р=0,001), 0,05±0,01 пкат (р=0,005) соответственно в сравнении с группой доноров – 0,03±0,002 пкат). Учитывая, что панкреатическая эластазная активность достоверно повышается при рН 8,8 только при панкреонекрозе (0,1±0,05 пкат (р=0,03) по сравнению с группой доноров 0,05±0,002 пкат), определение эластазной активности может иметь диагностическое значение при дифференциальной диагностике данной патологии.

3. Были определены возможные диагностические критерии для постановки диагноза острый панкреатит с панкреонекрозом и без него. При обработке результатов с помощью ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 7,4, при котором достигается наибольшая специфичность (77,8%) и чувствительность (84,21%) выбранного диагностического критерия – выше 0,138 пкат. (AUC=0,830, p=0,0001). При применении ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 7,4, при котором можно предположить наличие некроза с возможным инфицированием в поджелудочной железе – выше 0,179 пкат. Специфичность методики – 100%, чувствительность – 58,71%, (AUC=0,913, p=0,0001).

4. Также с помощью ROC-анализа был выявлен уровень эластазной активности сыворотки крови при рН 8,8, при котором достигается наибольшая специфичность (100%) и чувствительность (71,43%) выбранного диагностического критерия – выше 0,243 пкат, (AUC=0,762, p=0,0394).

5. Была определена ферментативная (протеолитическая) активность  42 изолятов микроорганизмов. В частности было установлено, что преимущественно изоляты P. aeruginosa (все 23 изолята) обладают эластазной активностью, а также данной активностью обладают и другие виды микроорганизмов, например возбудители внутрибольничных инфекций – S aureus и E.coli. Была определена БАПНА-амидазная активность 167 изолятов микроорганизмов и выявлено, что изоляты S. aureus (n=42) не обладают такой ферментативной активностью. Данная информация может быть использована для определения степени патогенности и идентификации изолятов микроорганизмов, а также корректировки антибактериальной и иммуностимулирующей терапии пациентов с хирургическими гнойно-воспалительными заболеваниями.

6. Выявлено достоверное повышение уровня эластазной активности сывороток крови у беременных женщин с инфекционной патологией, причем при рН 7,4 уровень данной активности был достоверно выше (0,068±0,02 пкат, р<0,05) , чем при рН 8,8 (0,054±0,03 пкат) что, вероятно, является результатом увеличения количества нейтрофилов в крови при присоединении инфекции. Схожие результаты были получены и при сравнении пациентов с гнойно-воспалительной патологией челюстно-лицевой области с группой доноров (0,021±0,002 пкат; 0,012 пкат±0,0012 пкат соответственно, р=0,0005), т.е. можно заключить, что значительной повышение активности нейтрофильной эластазы – это возможный маркер воспалительного процесса.

7. Определено, что эластазная активность сыворотки крови у пациентов с различными формами ИБС была достоверно выше чем у группы доноров (0,122±0,017 пкат, 0,083±0,019 пкат соответственно, р=0,045), что свидетельствует о процессах повреждения и развитии воспалительной реакции как на компоненты разрушенных клеток, так и на компоненты соединительной ткани (в частности эластина) у данных пациентов.

Библиографический список:

1. Australian Protease Network [Электронный ресурс] – Режим доступа :www. medbibl. ru. – Дата доступа : 15.05.2012.
2. Carroccio, A. [et al.] Usefulness of faecal elastase-1 assay in monitoring pancreatic function in childhood coeliac disease. / A. Carroccio; G. Iacono; S. Ippolito; F. Verghi // Italian Journal Of Gastroenterology And Hepatology. – 1998. – Vol. 30 (5). – P. 500-504.
3. Bairoch, A. The ENZYME databasein 2000 / A.Bairoch // Nucleic Acids Res. – 2000. – Vol. 28, N 1. – P. 304–305.
4. Paczek, L. Trypsin, elastase, plasmin andMMP-9 activity in the serum during the human ageing process / L. Paczek, W. Michalska, I. Bartlomiejczyii // Age. Ageing. – 2008 May. –Vol. 37, N 3. – P. 318–323.
5. Vine, N. Metalloproteinases in degenerative aortic disease / N. Vine, J.T. Powell // Clin. Sci (Lond). – 1991. – Vol. 81, N 2. – P. 233–239.
6. Xu, Y [et al. ] Pancreatic exocrine function and morphology following an episode of acute pancreatitis./ Y Xu; D Wu; Y Zeng; X Wang // Journal Pancreas. – 2012. – Vol. 41 (6), P. 922-927.
7. Rice, W.G., Weiss S.J. Regulation of proteolysis at the neutrophil substrate interface by secretory leukoprotease inhibitor / G.W. Rice, S.J. Weiss // Science. – 1990. – Vol. 249. – P. 178–181.
8. Neutrophil extracellular traps kill bacteria / Brinkmann V. [et al.] // Science — 2004. — Vol. 303, N 5663. — P.1532–1535.
9. Boudier, C., Bieth J.G. Oxidized mucus proteinase inhibitor: a fairly potent neutrophil elastase inhibitor / C. Boudier, J. G. Bieth // CBiochem. J. – 1994. – Vol. 303. – P. 61–68.
10. Inhibition of human leukocyte elastase bound to elastin: relative ineffectiveness and two mechanisms of inhibitory activity / H.M. Morrison // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. – 1990. – Vol. 2. – P. 263–269.
11. Saunders, W.B., Bayless K.J., Davis G.E. MMP–1 activation by serine proteases and MMP– 10 induces human capillary tubular network collapse and regression in 3D collagen matrices / W.B. Saunders, K.J. Bayless, G.E. Davis // J. Cell. Sci. – 2005. – Vol. 118 (pt 10). – P. 2325–2340.
12. Shapiro, S.D., Senior R.M. Matrix metalloproteinases. Matrix degradation and more / S.D. Shapiro, R.M. Senior // Am. J. Respir. CellMol. Biol. – 1999. – Vol. 20. – P. 1100–1102.
13. Аверьянов, А.В. Роль нейтрофильной эластазы в патогенезе хронической обструктивной болезни лёгких / А. В. Аверьянов // Цитокины и воспаление. – 2007. –Т. 6, № 4. – С. 3–8.
14. Супотницкий, М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии / М. В. Супотницкий. – Москва: Вузовская книга, 2000. – 376 с.
15. Morihara K., Tsuzuki H, Production of protease and elastase by Pseudomonas aeruginosa strains isolated from patients. / K. Morihara, H. Tsuzuki // Infection and immunity. – 1977. – Vol 15(3). – P. – 679–685.
16. Окулич, В.К. Методика определения активности эластазы в биологических жидкостях / В.К. Окулич, Д.Г. Сосинович, А.В. Корнилов, Ю.Г. Савкина, С.А. Сенькович // инструкция на метод, регистрационный №66 – 2011 г.
17. Окулич, В.К. / Метод определения эластазной активности микроорганизмов / В.К. Окулич, А.В. Корнилов, Ю.Г. Савкина, А.Р. Прудников // инструкция на метод регистрационный №3 -2013 г.




Рецензии:

16.08.2016, 11:53 Ташпулатова Фатима Кудратовна
Рецензия: Рецензия на статью Прудникова Александра Руслановича «Ферментативная протеолитическая активность, которая определяется в биологических объектах» Статья посвящена актуальной теме- изучению протеолитической ферментативной активности биологических жидкостей и микроорганизмов у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями и различными формами ИБС. Цель и задачи поставлены в соответствии изучаемой проблеме. Методы исследования современны и что очень важно доступны в практическом здравоохранении. Особо необходимо отметить, что в ходе проведенных исследований модифицирован метод определения эластазной активности биологических жидкостей и микроорганизмов. Автором на основе полученных данных предложены диагностические критерии острого панкреатита с панкреонекрозом или без него по уровню эластазной активности сыворотки крови. В работе получены результаты, которые указывают о необходимости проведения более глубоких научных исследований в этой области. Полученные данные обработаны статистическими методами, приведены достоверность разницы между группами сравнения. Статья иллюстрирована таблицами и рисунками, которые наглядно отражают суть работы. Выводы логически вытекают из результатов представленных в статье. Заключение. Статью Прудникова Александра Руслановича «Ферментативная протеолитическая активность, которая определяется в биологических объектах» рекомендую к публикации. Заведующая кафедрой фтизиатрии Ташкентского педиатрического медицинского института, д.м.н, доцент Ташпулатова Ф.К.



Комментарии пользователей:

Оставить комментарий


 
 

Вверх