Публикация научных статей.
Вход на сайт
E-mail:
Пароль:
Запомнить
Регистрация/
Забыли пароль?
Вакпрофи. Публикация статей ВАК, Scopus
Научные направления
Поделиться:
Статья опубликована в №67 (март) 2019
Разделы: Медицина
Размещена 20.03.2019. Последняя правка: 20.04.2019.
Просмотров - 345

Влияние Ганодермы Луцидум на состояние окислительного стресса на модели экспериментальных животных

Abilov Pulat Melisovich

ассистент

Ташкентский медицинский педиатрический институт

преподаватель

Ирискулов Бахтиёр Уктамович - профессор, зав кафедрой Нормальной и Патологической физиологии ТМА


Аннотация:
В данной статье обсуждается влияние Ганодермы Луцидум на процессы оксидативного стресса на модели экспериментальных животных. Обобщены результаты, даны соответствующие выводы.


Abstract:
This article discusses the effect of Ganoderma Lucidum on the processes of oxidative stress in experimental animal models. The results are summarized, the corresponding conclusions are given.


Ключевые слова:
оксидативный стресс; свободные радикалы; активные формы кислорода; Ганодерма Луцидум

Keywords:
oxidative stress; free radicals; reactive oxygen species; Ganoderma Lucidum


УДК 616.61-036.12:577.19-036

Актуальность. Биомаркеры определяются как меры, которые можно использовать в качестве индикаторов нормальных биологических процессов, патологических процессов или фармакологических и / или биохимических реакций на терапевтическое / диетическое вмешательство. Биомаркеры используются для обследования здоровья, диагностики патологических процессов, оценке реакции и прогноза лечения, разработка безопасных и эффективных лекарственных средств и оценка эффектов лекарств, продуктов питания, напитков и добавок. Перекисное окисление липидов - основное последствие окислительного стресса и причина окислительного повреждения [1]. Были предложены различные биомаркеры для перекисного окисления липидов, разработаны и применены для биологических образцов от людей и экспериментальных животных. Существенные доказательства свидетельствуют об ассоциации между уровнем этих биомаркеров и развитием многих заболеваний. Соответственно, продукты перекисного окисления липидов получили большое внимание как биомаркеры окислительного стресса и заболеваний и также в качестве индикаторов антиоксидантных эффектов и преимуществ и ограничений различных биомаркеров и методов измерения, что явилось предметом. обширных исследований и аргументов [6].

Липиды подвержены окислению как ферментами, так и неферментативными окислителями. Особенно полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) обладающие более чем двумя цис-двойными связями, каждая из которых разделена одной  метиленовой группой и их эфиры легко окисляются свободным радикалом через опосредованное окисление цепи, называемое перекисным окислением липидов, которое было показано, что они нарушают мембранные функции и инактивируют белки.

Тетрахлористый углерод ССl4 на протяжении многих лет используется в экспериментальной медицине как модель оксидативного стресса. В связи с особенностями молекулярных механизмов действия ССl4 на субклеточные мембраны гепатоцитов (микросомальная реакция, перекисное окисление липидов как механизм нарушения каталитических свойств мембраносвязанных ферментов) представляет значительный интерес как модель молекулярной патологии мембранных структур.

Установлено, что в основе механизма действия на организм большинства факторов среды и условий жизнедеятельности лежит избыточная продукция свободных радикалов, ведущая к нарушению свободнорадикального гомеостаза в результате развития окислительного стресса.

Поэтому разработка биологически активных веществ, расширяющих пределы адаптации организма позволит повысить неспецифическую устойчивость организма к экстремальным воздействиям. Так как нарушение свободнорадикальных процессов сопровождается развитием гипоксического состояния, то необходимо включение в комплексную профилактику и терапию заболеваний биологически активных веществ, способных восстанавливать защитную способность организма.

В этой связи определенный интерес вызывает гриб Ганодерма Луцидум. В многочисленных работах доказана эффективность Ганодермы Луцидум повышать неспецифическую, специфическую и противоопухолевую защиту организма путем усиления активации Т-клеток за счет увеличения количества белка RANTES, относящихся к β-хемокинам. Также немногочисленными работами доказано противоопухолевое действие Ганодермы Луцидум (Qi-zhen Cao et at., 2016). Полисахариды, представленные в Ганодерме Лецидум (β-δ-полиглюканы, ланостан, ганодеран) способны связывать и выводить свободные радикалы, нормализовать метаболические процессы, повышать выносливость организма к гипоксии (Zhao Zhonghui et at., 2013).

В то же время не до конца изучено действие Ганодермы Луцидум на физиологическое состояние организма, а также возможность использования для коррекции изменений свободнорадикальных процессов, что и послужило актуальностью проводимого исследования.

Цель исследования. Изучить влияние Ганодермы Луцидум на свободнорадикальные процессы в условиях окислительного стресса на модели экспериментальных животных.

Материалы и методы исследования. Для осуществления поставленной цели были исследованы белые беспородные мыши обоего пола в количестве 100 шт массой 15-20 гр. Эксперимент длился 30 суток и проходил  с соблюдением правил, предусмотренных Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных разных видов. Все мыши находились в стандартных условиях с естественной сменой освещения и соблюдением общевиварийного рациона. У всех животных был свободный доступ к пище и воде.

Материалы исследования. Все экспериментальные животные были разделены на 4 группы:

1 группа – 10 мышей – контрольная, абсолютно здоровые мыши

2 группа – 1 основная группа (20 мышей), у которых острую печеночную недостаточность вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения 50% ССl4 0,06 мл масляного раствора (оливковое масло) – из расчета 0,3 мл на 100 гр тела

3 группа 2 основная (20 мышей), у которых острую печеночную недостаточность вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения 50% ССl4 0,06 мл масляного раствора (оливковое масло) – из расчета 0,3 мл на 100 гр тела, но коррекцию обменных нарушений проводили интактным препаратом (5%-2,0 ml аскорбиновой кислоты).

4 группа 3 основная (40 мышей), у которых острую печеночную недостаточность вызывали путем однократного внутрибрюшинного введения 50% ССl4 0,06 мл масляного раствора (оливковое масло) – из расчета 0,3 мл на 100 гр тела, но коррекцию обменных нарушений проводили биологически активными веществами на основе Ганодермы Луцидум (в дозировке 100 mg/kg массы тела).

Эвтаназию животных проводили под эфирным наркозом, после чего декапитировали на 3,10, 20 и 30 сутки и определяли в сыворотки крови биохимические показатели перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной защиты.

Методы исследования.

  1. Определение активности ферментов дыхательной цепи митохондрий путем измерения активности цитохрома С, А3, окислительного фосфорилирования и сопряженности оксидативного стресса на фоне введения Ганодермы Луцидум
  2. Определение активности свободных радикалов путем определения диеновых, триеновых конъюгантов на фоне введения Ганодермы Луцидум
  3. Определение архитектоники структурных форм гепатоцитов на фоне введения Ганодермы Луцидум.
  4. Статистические (критерий Манна-Уинни, Вилконсона).

Измерение активности ферментов дыхательной цепи митохондрий путем измерения активности цитохрома С определяли спектрофотометрическим методом, который основан на измерении оптической плотности раствора восстановленного цитохрома с, имеющего максимум поглощения 550 нм (восстановление цитохрома с сопровождается изменением цвета раствора от красновато-оранжевого до ярко-розового) Показателем активности служит величина падения оптической плотности раствора за определенный промежуток времени. Измерение активности цитохрома А3 определяли аналогичным образом, так как цитохром а3 катализирует окисление цитохрома с. Определение окислительного фосфорилирования и сопряженности оксидативного стресса проводили по методу Чанса-Вильямса, который основан на том, что в отсутствие АДФ фосфорилирование не идет. Окисление же имеет определенную величину. При добавлении АДФ в инкубационную среду начинает идти фосфорилирование и происходит стимулирование окислительной активности митохондрий.

Определение активности свободных радикалов путем определения диеновых, триеновых конъюгантов основан на принципе перегруппировки двойных связей и возникновением системы сопряженных диеновых структур, имеющих максимум поглощения при 232-234 нм с плечом в области 260-280 нм, соответствующим сопряженным кетодиенам.

Определение цитоархитектоники гепатоцитов проводили по стандартной методике. Кусочки печени мышей фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафинованные блоки, из которых с помощью микротома приготавливали срезы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Исследование проводили сразу после лечения, через 3,7, 10 и 30 суток.

Результаты исследования.

Результаты гистологических исследований.

Токсическое поражение печени воздействием ССl4 приводит к появление в печени мышей признаков воспаления, жирового перерождения, фиброза. Дальнейшее воздействие тетрахлористым углеродом приводит к появлению соединительной ткани. В 1, 2 основных группах гепатоциты по ходу соединительнотканных тяжей вакуолизированы и содержат большое количество липидных капель (рис.1).

 


Рис.1. Признаки воспаления в гепатоцитах после воздействия ССl4.

 

Стенки сосудов утолщены и фиброзированы. В паренхиме печени, особенно вблизи сосудов видны активированные клетки Купфера и лейкоцитарные инфильтраты. В 1 и 2 основных группах паренхима печени регенерирует очень слабо, что связано с практически полным отсутствием митозов в гепатоцитах.

В 3 основной группе паренхима печени активно регенерирует, свидетельством чего являются часто встречающиеся митозы гепатоцитов, в то же время именно в этой группе, у которых мыши получали Ганодерму Луцидум жировая дистрофия была выражена значительно слабее, также влияние Ганодермы Луцидум было оценено на способности биологически активных веществ увеличивать степень фиброзирования процессов и уменьшения воспалительных процессов.

Изолированные гепатоциты в контрольной группе (нормальные мыши) имели правильную округлую форму с центрально расположенным ядром, четко очерченную плазматическую мембрану, большое количество цитоплазмы. В 1 и 2 основных группах гепатоциты были значительно разнообразнее по размерам, встречались очень крупные клетки с большими полиплоидными ядрами. В цитоплазме часто присутствовали вакуоли,  плазматическая мембрана имела много выпячиваний. В 3 основной группе после воздействия Ганодермы Луцидум доля неповрежденных гепатоцитов составила 68±2,0 % (р≤0,05) по сравнению с 2 и 3 основных группах (32,0±3,5%, р≤0,05).

Результаты биохимических исследований.

Гепатиты токсической природы получают все большее распространение в мире, что определяет большой интерес исследователей к данной проблеме (Рябинин, 2002). По общему мнению исследователей ключевым звеном патологического процесса является нарушение работы дыхательной цепи митохондрий гепатоцитов, в основе которого лежит усиление продукции АФК – окислительный стресс (Avasarala et al., 2006; Wang, Cederbaum, 2006). Вместе с тем литературные данные, посвященные исследованию состояния дыхательной цепи митохондрий при токсическом гепатите, не полны и весьма противоречивы (Morimoto et al., 1988; Krähenbühl et al., 1989; Harvey et al., 2000; Yang et al., 2004).

Проведенное исследование показало, что активность цитохрома с в 2 и 3 основных группах было значительно выше, чем в 1 основной группе. В частности это связано с влиянием тритерпеновых фракций и β-δ-полигюканов повышать цитохромоксидазу печени за счет повышения неспецифической резистентности организма в результате чего оптическая плотность раствора падает. Причем, в 3 основной группе активность цитохромоксидазы была выше на 37,8% (р≤0,05), чем в 1 и 2 основных группах и составляла 59,0±1,05 нмоль сукцината/мг белка в мин ( при норме 61,09±1,09 нмоль сукцината/мг белка в мин). В 1 и 2 основных группах активность цитохрома с была понижена на 38% (р≤0,01) и 44% (р≤0,01) соответственно. В результате после повышения активности цитохрома с ускорились эндогенные окислительно-восстановительные реакции и обменные процессы в тканях, улучшилась утилизация кислорода и снизилась гипоксия в тканях при отравлении ССl4.

Как известно, механизм оксилительного фосфорилирования и сопряженности оксидативного стресса заключается в том, что перенос каждой пары электронов от NADН на кислород сопровождается транслокацией 6 протонов с внутренней на наружную сторону митохондриальной мембраны.

В проведенном исследовании было изучено, что в 1 и 2 группах не происходило замкнутой мембранной системы. В результате отравления тетрахлористым углеродом АТФ в митохондриях не может образоваться в результате нарушения компонентов дыхательной цепи, причем активность ферментов, находящиеся на внутренней мембране митохондрий была ниже на 45±2,0% (р≤0,05), так как фосфорилирующие субъединицы и их белки не образовывали АТФ-синтазу, что скорее всего связано с отсутствием так называемого стебелька, который связывает фосфорилирующие субъединицы с мембранной белковой субъединицей и при этом не образуется молекула АТФ. Причем в 1 и 2 группах по видимому протоны не атакуют атомы кислорода, в результате чего не образуется АТФ.

В 3 группе после приема Ганодермы Луцидум, за счет входящего в состав органического германия, добавляются новые протоны, которые атакуют атомы кислорода и в результате чего образуется АТФ. Причем Ганодерма Луцидум приводит к образованию замкнутой мембранной системе, в результате чего функционирует векторная АТФ-синтаза и компоненты дыхательной цепи уложены в мембране упорядоченно. В частности, происходит то, что F1 –субъединица активируется в результате трех петель дыхательной цепи.

В 1 и 2 основных группах содержание АДФ было снижено на 45±3,0% (р≤0,01) и 56±2,5% (р≤0,01) соответственно. В 3 основной группе после приема Ганодермы Луцидум и на 3, 7, 10 и 30 сутки происходило достоверное увеличение содержания АДФ на 34,0±2,0%, 42,5±2,0%, 57,0±3,0% и 67±2,5% (р≤0,05) соответственно.



Рис 2. Динамика показания окислительного фосфорилирования и сопряженности оксидативного стресса до лечения

Рис.3. Динамика показания окислительного фосфорилирования и сопряженности оксидативного стресса после лечения.

 

После лечения Ганодермой Луцидум видно, что происходит повышение активности всей дыхательной цепи (цитохрома с,а, окислительного фосфорилирования и сопряженности оксидативного стресса).

Принцип метода определения диеновых конъюгантов основывается на установлении содержания первичных продуктов ПОЛ в крови по поглощению липидным экстрактом монохроматичного светового потока в ультрафиолетовой области спектра, так как молекулы с двумя сопряженными связями (диеновые конъюганты) обладают максимумом поглощения при 233 нм.

Причем, в 1 и 2 основных группах было определено содержание диеновых конъюгантов колебалась на уровне 0,400 ед. опт. пл/мг липидов (р≤0,001) причем в 3 группе после лечения Ганодермой Луцидум этот показатель составил 0,300 ед. опт. пл/мг липидов (р≤0,001).

Постепенное снижение диеновых и триеновых конъюгантов свидетельствует об успешном лечении и благоприятном прогнозе.


Рис. 4. Показатели диеновых и триеновых конъюгантов до и после лечения и через 30 суток после лечения.

Выводы:

  1. Изучение цитоархитектоники гепатоцитов выявило, что после воздействия токсического яда, такого как тетрахлористый углерод на фоне применения Ганодермы Луцидум происходила активная регенерация паренхимы печени, жировая дистрофия была выражена значительно слабее, чем в 1 и 2 основных группах.
  2. Активность цитохрома с, а после воздействия Ганодермы Луцидум была значительно выше, что связано с действием тритерпеновых фракций и β-δ- полиглюканов повышать цитохромоксидазу печени за счет повышения неспецифической резистентности организма.
  3. Постепенное снижение диеновых и триеновых конъюгантов на фоне применения Ганодермы Луцидум свидетельствует об успешном лечении и благоприятном прогнозе.
  4. Представленные результаты лечения оксидативного стресса биологически активными веществами на основе Ганодермы Луцидум позволяет использовать и в клинической практике.

Библиографический список:

1. Acute liver failure: A review for emergency physicians / Tim Montrief et. al. // American Journal of Emergency Medicine. 2019.-V.37.-P. 329-337
2. Acute-on-chronic liver failure in patients with alcohol-related liver disease / Thierry Gustot et. al. // JOURNAL OF HEPATOLOGY. 2019.-V.70.-P. 319-327
3. Еffects of some drugs on rat erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase: an in vitro and in vivo study / Ciftci M. et al. // Pol. J. Pharmacol. 2002. - V.54. - P.275-280.
4. Еvaluation of oxidative stress during apoptosis and necrosis caused by carbon tetrachloride in rat liver / Sun F. et al. // Biochim. Biophys. Acta. -2001. V. 1535, No.2. - P. 186-191.
5. Hepatoprotective activity of Ganoderma Lucidum triterpenoids in alcohol-induced liver injury in mice, an-ITRAQ-based ptoteomic analysis / Chao Zhao et. al. // Food Chemistry. 2019.-V.271.-P.148-156
6. Impaired endothelial autophagy promotes liver fibrosis by aggravating the oxidative stress response during acute liver injury / Maria Ruart et. al. // JOURNAL OF HEPATOLOGY. 2019.-V.70.-P.458-469




Рецензии:

24.03.2019, 14:22 Умарова Зарифа Фахриевна
Рецензия: Статья написана в соответствии с правилами журнала. Рекомендую для публикации.

26.03.2019 15:15 Ответ на рецензию автора Abilov Pulat Melisovich:
Спасибо за рецензию!

26.03.2019, 8:40 Манин Константин Владимирович
Рецензия: Статья рекомендуется к публикации в журнале. С наилучшими пожеланиями Манин К.В.
26.03.2019 10:10 Ответ на рецензию автора Abilov Pulat Melisovich:
Спасибо за рецензию!



Комментарии пользователей:

Оставить комментарий


 
 

Вверх