Статья опубликована в №75 (ноябрь) 2019
Разделы: Фармацевтика
Размещена 26.11.2019. Последняя правка: 26.11.2019.
Просмотров - 1453

Тканерегенерирующая активность и антиэкссудативный и антипролиферативный эффект биологически активных веществ пептидной природы из семян чернушки посевной Nigella sativa

Ощепкова Юлия Игоревна

доктор химических наук

Институт биоорганической химии АН РУз

заведующий лаборатории ХБиП

Аманликова Дильфуза Абдуганиевна – базовый докторант лаборатории Химия белков и пептидов Института биоорганической химии имени академика А.С.Садыкова Академии Наук Республики Узбекистан. Рахмонова Гульнара Гуломовна – младший научный сотрудник лаборатории фармакологии Института биоорганической химии имени академика А.С.Садыкова Академии Наук Республики Узбекистан.

УДК 615.212.07

Введение

Воспалительный процесс является ведущим патогенетическим звеном многих заболеваний, которые составляют около 80% всей патологии в практике врача. В настоящее время в комплексной терапии острых и хронических заболеваний для купирования боли и уменьшения выраженности воспалительной реакции применяют большое число лекарственных препаратов преимущественно из группы нестероидных противовоспалительных средств и глюкокортикостероидов [1]. Однако, наряду с благоприятным фармакологическим действием и достаточной степенью клинической эффективности, все они вызывают ряд нежелательных побочных реакций [2]. Применение лекарственных средств природного происхождения имеет ряд преимуществ перед синтетическими аналогами. Сложный комплекс биологически активных веществ оказывает более мягкий, но достаточно выраженный лечебный эффект, что крайне важно при лечении хронических заболеваний. Лекарственные средства природного происхождения, воздействуя системно на организм, регулируют функции различных систем и органов и практически не имеют побочных эффектов, не вызывают, как правило, аллергии и могут применяться как для лечения, так и для профилактики. Хорошая переносимость и высокая безопасность природных препаратов делают их незаменимыми для проведения профилактики и противорецидивного лечения у взрослых и детей. Применение препаратов природного происхождения позволяет избежать развития привыкания и лекарственной зависимости, стимулировать собственные адаптационные и защитные системы организма.

Актуальность

В настоящее время недостаточно широко применяются противовоспалительные и ранозаживляющие свойства лекарственных растений и препаратов из них, отличающиеся, может быть, несколько менее выраженным эффектом, но лучшей переносимостью и меньшей токсичностью. В связи с этим поиск новых эффективных противовоспалительных препаратов растительного происхождения является актуальным. Преимущества применения растительных средств обусловлены широким спектром фармакологических свойств, мягкостью, отсутствием побочных действий при длительном применении, так как они по химической природе близки организму человека и легко включаются в биохимические процессы [3].

В процессе заживления ран участвуют три биологических механизма.
Эпителизация — процесс, при котором клетки многослойного плоского эпителия перемещаются и пролиферируют, закрывая дефекты (с поражением не на всю глубину) кожи или слизистой оболочки. Примерами такой эпителизации могут служить заживление ран на месте взятия неполных по глубине донорских лоскутов для пересадки кожи, заживление ссадин, волдырей, ожогов I и II степеней. Стягивание (конвергенция) раны — процесс, при котором происходит спонтанное закрытие ран кожи (с поражением на всю глубину) или сокращение после повреждения просвета трубчатых органов, таких как общий желчный проток или пищевод.
Отложение коллагена  — процесс, при котором фибробласты перемещаются к месту повреждения и продуцируют новый соединительнотканный матрикс. Переплетающиеся в различных направлениях коллагеновые волокна обеспечивают прочность и интегрированность рубца во всех хорошо заживших ранах.
Наиболее активно в процессе заживления и регенерации тканей участвуют биологически активные вещества пептидной природы, относящиеся к классу липид переносящих белков, за счет взаимодействия с бислойными липидными мембранами при наличии в своем составе таких фосфолипидов как диацилглицерол, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин.

Цели и задачи:

Цель: оценка тканерегенерирующей и противовоспалительной активности биологически активных пептидов из семян чернушки посевной Nigellasativa на моделях механических ран и термических ожогов и острого экссудативного и хронического пролиферативного воспаления.

Задачи:

Изучение тканерегенирирующей ранозаживляющей активности на моделях механических ран и термических ожогов.
Изучение противовоспалительной активности биологически активных веществ пептидной природы на моделях «острый формалиновый отек», «острый карагинановый отек».
Изучение влияния биологически активнъх веществ пептидной природы на пролиферативные процессы на модели «ватной гранулемы» по методу Ф.П.Тринус.

Материалы и методы

Экспериментальные животные

Исследования проводились на взрослых белых крысах самцах и самках с массой тела 180-200 гр. Подопытных животных содержали в условиях вивария (с естественным режимом освещения; при температуре 22–24^оС; относительной влажности воздуха 40–50 %) с использованием стандартной диеты (ГОСТ Р 50258-92). Животных содержали в стандартных условиях на стандартном рационе. Опыты на животных проводили в соответствии с правилами «Европейской Конвенции защиты животных, используемых в экспериментах и других научных целях» [4]. Перед постановкой эксперимента животные проходили карантин в течение 10–14 дней [5, 6]. В ходе эксперимента были сформированы экспериментальные группы животных.

 Исследуемые объекты

В качестве изучаемых объектов в данной работе использовалась пептидная фракция из семян чернушки посевной Nigella sativa, относящаяся к классу липид-переносящих и имеющая в своем составе фосфатидилхолин.

Для изучения противовоспалительной активности пептидную фракцию замораживали в жидком азоте, лиофильно высушивали, перерастворяли в воде и вновь высушивали. Сухое вещество перерастворяли в 50 мкл воды и определяли концентрацию по спектру поглощения в УФ области.

Модели механических ран и термических ожогов.

Крыс распределяют по группам: 1 группа - контроль-интакт, 2 группа – опыт (термические ожоги), 3 группа – опыт (механические раны). У крыс на правом бедре и части спины выстригают шерсть. Во второй группе на выстриженный участок кожи накладывают цилиндр и наливают кипяток, выдерживают в течение 20 секунд для образования ожогов. Через 20 минут производят обработку ожога липид-переносящим белком. В третьей группе на выстриженном участке кожи вырезают раны размером 1.5х1.5 см. Через 30 минут производят обработку раны липид-переносящим белком. В опытных группах ежедневно проводят обработку. На третий и седьмой день после лечения проводят подготовку образцов для гистологического исследования. В контрольной и опытных группах по 2 особи крыс усыпляют под эфирным наркозом и проводят срез слоя кожи. Образцы консервируют в 12% растворе формалина. Образцы кожи окрашивают гемотоксилин-эозином и проводят осмотр под микроскопом.

 Модель «острый формалиновый отек лапы»

Противовоспалительную активность биологически активных веществ пептидной природы оценивали в экспериментах на модели «формалинового» отека лапы. Острый воспалительный отек вызывали субплантарным введением (под подошвенный апоневроз) в правую заднюю лапку крысы 0, 1 мл 2% водного раствора формалина [6]. Выраженность отека оценивали онкометрически по изменению объема стопы до и через 3 часа, а также в динамике через каждые два дня после введения раствора формалина. Противовоспалительную активность исследуемых соединений выражали в %% угнетения отека.

Перед введением, вещества разводили в воде и вводили перорально с помощью зонда за час до инъекции формалина в дозе 0,01, 0,1 и 1, 0 мг/кг.

Подопытные животные были разделены на 4 группы (по 5 крыс в каждой).

 Модель каррагинанового воспаления

Исследования проводили на модели острого экссудативного воспаления, вызванного субплантарным введением классического флогогена - каррагинана. Опыты были выполнены на крысах обоего пола массой 180±20 г.  Исследуемые препараты вводили  в виде водных растворов перорально с помощью зонда.  Через 1 час после введения растворов под апоневроз задней лапки крысы инъецировали 0,1 мл  1 % раствора каррагинана [7].

Оценку противовоспалительного эффекта проводили через 3 часа после индукции воспаления. Величину отека вычисляли по разнице между объемами невоспаленной и воспаленной конечности. Антиэкссудативную активность определяли по степени уменьшения отека у опытных животных в сравнении с контрольными и выражали в процентах [8].

Расчет антиэкссудативной активности проводили по формуле:

ПА=ΔV_o-ΔV_к/ΔV_к *100%

ПА - противовоспалительная активность, в процентах;

ΔV_к- объем лапы в контроле;

ΔV_o-объем лапы в опытной группе.

 Модель «ватной гранулемы»

Антипролиферативные свойства изучали на модели «ватной гранулёмы» по методу Ф.П.Тринус [9]. Крысам, находящимся под лёгким эфирным наркозом, в области спины тщательно выстригали шерсть и в асептических условиях делали продольный разрез кожи и подкожной клетчатки длиной 1–2 см. Затем пинцетом, через образовавшийся разрез кожи, в подкожной клетчатке формировали полость, в которую помещали предварительно простерилизованный ватный шарик массой 15 мг и накладывали 1–2 шва. Пептидную фракцию   вводили внутрижелудочно 1 раз в сутки в течение 7 дней. Через 7 дней имплантированный шарик с образовавшейся фиброзно-грануляционной тканью извлекали и высушивали до постоянной массы при 70°С в течение 24 часов. Массу образовавшейся грануляционно-фиброзной ткани определяли по разнице между массой высушенной гранулёмы и массой имплантированного ватного шарика.

 Методы статистического анализа

Статистическую обработку результатов производили с применением стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2003. Для оценки достоверности различий выборок, имеющих нормальное распределение, применяли параметрический t-критерий Стьюдента. За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95% и более (р≤0,01).

 Результаты

В качестве изучаемого объекта взят липид-переносящий белок, выделенный из семян чернушки посевной Nigella sativa. В наших  предыдущих работах [10-12] было показано, что данный пептид содержит в своем составе фосфатидилхолин и, следовательно, может участвовать в процессе заживления и регенерации тканей.

Влияние исследуемого объекта на модели механических ран и термических ожогов.
Исследования проводились на животных, на моделях механических ран и термических ожогов. На 3-е и 7-е сутки после лечения были взяты образцы кожи и проведен гистологический осмотр в динамике заживления в сравнении с контрольными образцами и образцами, взятыми после вызывания ран и ожогов.

В образцах кожи, осмотренных под микроскопом после механических ран через 3 дня лечения, участок поражения отсутствует, то есть, происходит полное заживление раны. Через 7 дней лечения под микроскопом препарат представляет довольно длинный участок кожи крысы, на котором хорошо выделяются волосы, эпителиальный пласт и соединительно-тканная часть кожи. На всем протяжении кожа имеет обычное строение, сверху покрыта эпителием, под которым находится соединительно-тканная часть кожи. Как обычно, эпителиальная часть состоит из базального, шиповатого и зернистого слоев, верхняя часть представлена роговой пластинкой. Над зернистым слоем обнаруживается слой полностью ороговевших клеток, где ядро и цитоплазма не различаются и ороговевшие клетки представлены полоской розового цвета. Как правило, эти полоски местами частично, местами полностью отделены от эпителиального пласта. Верхние слои этой полоски разрыхлены и отслоены.

Под эпителием выявляется массивный слой кожи, как обычно, состоящий из плотной неоформленной соединительной ткани, содержащей большое число корней волос, а вокруг них потовые и сальные железы. Глубже соединительной ткани находится небольшая прослойка поперечно-полосатой мышечной ткани, которая не обнаруживает особых изменений.

В целом, морфологическая картина данного случая соответствует картине контрольно-интактных животных.

В образцах кожи, пораженных ожогом, наблюдается участок, покрытый коогуляционной пленкой (корочкой), состоящей из ленты расположенных клеток инфильтрата. Небольшой участок кожи оголен, коогуляционная пленка отсутствует. Нижележащая соединительная ткань разрыхлена, коллагеновые волокна истончены. Через 3 дня лечения при малом увеличении микроскопа на гистологическом препарате кожи выявляется участок с дефектом – раневой поверхностью. В одном случае дефект небольшой, края раны приподняты, а пораженный участок покрыт нежной грануляционной тканью, которая густо инфильтрирована лимфогистоцитарными элементами, однако грануляционная ткань отделена от нижележащей соединительной тканью. Нижележащие и пограничные участки кожи с ожоговой поверхностью имеют обычной строение. В другом случае, грануляционная ткань равномерно покрывает раневую поверхность и состоит из нежной волокнистой соединительной ткани, также густо инфильтрированной лимфогистоцитарными элементами. На данном этапе отсутствует полное заживление раны, хотя значительно отличается от не леченых случаев.

Через 7 дней лечения выявляется участок кожи, покрытый коогуляционной пленкой, причем эта затвердевшая корочка отделена от нижележащей соединительной ткани. Следует отметить, что ожогом был поражен не только эпителиальный пласт, но также нижележащая соединительная ткань, которые вместе формируют десквалированную корочку. Эта корочка в своей верхней части образована распадом клеток эпителиального пласта, поэтому клеточное строение здесь не различается. Ниже отечной полоски расположена соединительно-тканная часть, которая на первый взгляд имеет обычное строение и представлена коллагеновыми волокнами, ориентированными в различных направлениях. Под небольшой прослойкой соединительной ткани выявляется мощный слой жировой ткани, состоящий из скопления жировых клеток. В этой толще выявляются кровеносные сосуды, расширенные умеренно и содержащие форменные элементы крови. Эта ткань постепенно переходит в нормальный участок, где гистологическая структура имеет обычное строение.

Влияние исследуемого объекта на модели формалинового отека

Было выявлено, что при субплантарном введении 0,1 мл 2% раствора формалина у подопытных крыс развивается выраженный отек лапы, о чем свидетельствует достоверное увеличение ее объема. Отмечено, что максимальный отек лапки (пик воспаления) развивался через сутки после введения формалина, при этом объем лапки у подопытных животных контрольной группы увеличивался в среднем на 16 % (р≤0,01). Следует отметить, что и через 48 часов после введения формалина объем лапы у подопытных животных контрольной группы был в среднем в 1,3 раза (28,6 %) больше, чем до введения флогогенного фактора. Через 7 суток после введения формалина различий в выраженности отека в опыте и контроле выявлено не было (табл.1).

При пероральном введении исследованных биологически активных веществ пептидной природы отмечалось уменьшение выраженности формалинового отека.

В группе крыс, получавших исследуемое вещество в дозе 0,01 мг/кг, максимальный отек лапки развивался также через 1 сутки после введения формалина, при этом увеличиваясь в среднем на 60 %. Через 3 суток после введения формалина отек снижался  до 30 %; к 5 суткам -  до 20% и достигая через 7 дней - 5,9%.

У крыс, получавших препарат в дозе 0,1 мг/кг, развивался максимальный отек лапок через 1 сутки, увеличиваясь до 42%, и постепенно снижался. В последующие дни показатели прироста объема конечности крыс этой группы не отличались от таковых в контроле (рис.1).

У животных, получавших исследуемый препарат в дозе 1,0 мг/кг, была зафиксирована лишь тенденция к снижению процента прироста воспаленной конечности через 3,5 и 7 сутки эксперимента.

Проведенные исследования показали, что испытуемые соединения в концентрации 0,01 и 0,1 мг/мл проявляют антиэкссудативный эффект, который отмечен через 3-и и 5-е сутки, а также через 7 суток после введения формалина.

Влияние исследуемого объекта на модели каррагинанового отека

Острое экссудативное воспаление, вызванное каррагинаном, было изучено на экспериментальных животных – крысах при внутрижелудочном введении биологически активных веществ в дозах 0,1 и 1 мг/кг.

В контроле максимальный отек наступает через 3 часа и составляет 112,5±12,5 % по отношению к исходным показателям (табл.2).

В опыте максимальный отек у крыс, наступивший через 3 часа после введения карагинана, составил 75,0±13,8 % и 62,5±5,0 % в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг, соответственно.

Через 24 часа отек стопы в контроле был еще заметен, тогда как в опыте объем стопы возвратился к исходному состоянию.

Проведенные исследования показали, что испытуемые соединения, в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг, обладают противовоспалительной активностью, снижая степень отечности через 3 часа на 33,1 и 44,2 %, соответственно.

 Влияние исследуемого объекта на модели ватной гранулемы

В очаге воспаления изучено влияние биологически активных веществ на процессы пролиферации. Полученные данные свидетельствуют, что у контрольных животных масса влажной гранулемы составляет 384,3±25,6 мг, а при применении испытуемых соединений в концентрациях 10 и 20 мг/кг – 308,0±30,0 мг и 311,0±32,1, соответственно (табл.3).

Биологически активные вещества угнедают экссудативные процессы на 19,8 % и 19,1% и наблюдается выраженное антиэкссудативное действие в снижении массы экссудата в 1,25 и 1,24 раза относительно контрольных значений.

Масса сухой грануляционно-фиброзной ткани при использовании биологически активных веществ в дозах 10 и 20 мг/кг уменьшилась в 1,5 и 1,43 раза, соответственно, по сравнению с показателями группы нелеченых животных.

Установлено, что биологически активные вещества пептидной природы угнетают пролиферативные процессы на 33 % и 29,8 % и превосходят действие по антипролиферативному свойству - в 1,2 -1,5 раза по отношению к контролю.

Таким образом, результаты экспериментального исследования показали, что изучаемые биологически активные вещества пептидной природы из семян чернушки посевной Nigellasativa обладают противовоспалительной активностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предварительные полученные результаты позволяют рекомендовать исследуемые соединения для их использования в создании фармацевтических композиций для лечений воспалительных заболеваний и расширенных доклинических испытаний потенциальных лекарственных средств с их противовоспалительной активностью, тем самым расширив арсенал эффективных терапевтических средств, участвующих в регенерации тканей. На основе пептидной фракции, представляющей собой липид-переносящий белок, в дальнейшем,планируется создание  фармацевтической композиции для лечения язвенных колитов различной этиологии.

1. Казаишвили Ю.Г. Попов Н.С. Исследование противоспалительной активности новых производных тиадиазола при формалиновом отеке лапы у крыс // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 3
2. Зарудий Р.Ф., Мышкин В.А., Зарудий Ф.С. Противоязвенное действие дибунола (тонарола)// Экспериментальная и клиническая фармакология. – 1998. – Т.61, №5. – с.21-23.
3. Петров Е.В., Чехирова Г.В., Асеева Т.А., Николаев С.М. Лекарственные средства на основе растительных ресурсов Байкальского региона. – Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2008. – 94 с.
4. Европейская конвенция «О защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях». – 1986 [Электронный ресурс]. – URL: http://www.lawmix.ru/abro.php?id=11036.
5. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ /Под общей редакцией чл.-корр. РАМН проф. Р. У. Хабриева. – 2-изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2005. – 832 с.
6. Сернов Л. Н. Элементы экспериментальной фармакологии / Л. Н. Сернов, В. В. Гацура. – М.: ВНЦ БАВ, 2000. – 352 с.
7. Методические рекомендации по доклиническому изучению нестероидных противовоспалительных лекарственных средств//Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств/ I часть, 2012, Миронов А.Н., Бунятян Н.Д. и др., 2012г.С .746-758.
8. Абу Захер Кхалед, Л. В. Деримедведь //Изучение биологической активности суммы катехинов и лейкоантоцианидинов// ПРОВИЗОР. Журнал - 2002. выпуск - №- 14.
9. Тринус Ф.П., Мохорт Н.А., Клебанов Б.М. Нестероидные противовоспалительные средства. – Киев, 1975. – 239 с.
10. Ощепкова Ю.И. Взаимодействие липидпереносящих белков из семян седаны Nigella sativa с мембранами./Ощепкова Ю.И., Тукфатуллина И.И., Мерзляк П.Г. и др. // Узбекский биологический журнал. - 2009. – №2. – С.7-11.
11. Ощепкова Ю.И. Выделение липид-переносящего белка Ns-LTP1 из семян чернушки посевной (Nigella sativa)./ Ощепкова Ю.И., Вешкурова О.Н., Рогожин Е.А. и др. // Биоорганическая химия. – 2009. - №3. – С.344-349.
12. Ощепкова Ю.И. Взаимодействие липидпереносящих белков из семян седаны Nigella sativa с липидными мембранами. / Ощепкова Ю.И., Сонькина С., Салахутдинов Б.А. и др. // Химия природных соединений. – 2010. - №4. – С.505-507.

Рецензии:

27.11.2019, 11:50 Слипченко Галина Дмитриевна
Рецензия: Статья актуальна, однако какой препарат сравнения вы брали? Какие БАВ дают возможность получить Вам противоспалительный еффект? Литература на которую вы ссылаетесь тоже старовата, есть более свежие актуальные публикации. Какую лекарственную форму Вы предлагаете в дальнейшем получить?

7.12.2019, 6:06 Гурьянова Марина Николаевна
Рецензия: Статья рекомендуется к публикации. Использованные методики. соответствуют рекомендациям по доклиническим исследованиям Исследований проведено много. По трём разным методикам проведено исследование противовоспалительной активности, что даёт возможность и сравнить статистические данные и верно обработать их. Замечание- в статье нет ссылок на препарат сравнения.



Комментарии пользователей:

Оставить комментарий