Публикация научных статей.
Вход на сайт
E-mail:
Пароль:
Запомнить
Регистрация/
Забыли пароль?
Международный научно-исследовательский журнал публикации ВАК
Научные направления
Поделиться:
Статья опубликована в №1 (сентябрь) 2013
Разделы: Биология, Ботаника
Размещена 21.09.2013. Последняя правка: 21.09.2013.

Гормональный комплекс растений как один из основополагающих факторов успешного введения в культуру in vitro

Шейко Елена Анатольевна

кандидат биологических наук

Институт ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины

младший научный сотрудник, отдел фитогормонологии

Аннотация:
Впервые установлена взаимосвязь интенсивности каллусогенеза из эксплантов вегетативных и генеративных органов орхидных и соотношения составляющих фитогормонального комплекса на определенных этапах онтогенеза, что необходимо учитывать при разработке методов микроклонального размножения этих видов. Показано, что максимальная частота каллусогенеза в определенных условиях культивирования характерна для генеративных органов орхидей, которые отличаются повышенным содержанием цитокининов, индолилуксусной кислоты и низким уровнем абсцизовой кислоты.


Abstract:
It is the first time when there has been found the interrelation of tylosis genesis intensity of orchid vegetative and generative organs explants and the content and ratio of the phytohormonal complex components at the specified stages of ontogenesis that must be taken into account in the elaboration of methods of this species microclonal reproduction. The maximum frequency of callusogenesis under these conditions of cultivation has been shown to be typical of the orchid generative organs since they are characterized by increased content of endogenous cytokinins and IAA and low level of ABA.


Ключевые слова:
Orchidaceae, фитогормоны, культура in vitro, эксплант, каллусогенез

Keywords:
Orchidaceae, phytohormones, culture in vitro, explants, callusogenesis


Введение

Традиционно, приоритетными объектами биотехнологических исследований является изучение различных видов, сортов и гибридов культурных растений. В настоящее время в мире появилась тенденция применения для охраны растительных ресурсов биотехнологических методов, которые базируются на культивировании клеток, тканей и органов растений в контролируемых условиях in vitro, при этом все чаще для подобных исследований используют виды дикорастущей флоры. Эти методы становятся составляющей частью общей стратегии сохранения генофонда растений, среди которых развиваются такие направления биотехнологии, как клонирование и размножение редких, исчезающих дикорастущих видов, создание генетических банков на основе пересадочных культур и криобанков. Однако, эти методы пока еще не нашли широкого применения в работе по сохранению биоразнообразия растительных ресурсов умеренной зоны. Главная причина такого положения заключается в недостаточной изученности биологических особенностей таких видов растений, их жизненных репродуктивных стратегий, а также ряда теоретических и методических аспектов, которые связаны с моделированием и регуляцией морфогенетических процессов в культуре тканей и органов in vitro. При этом главной проблемой является подбор оптимальных условий для реализации морфогенетического потенциала эксплантов в условиях in vitro, экспериментальное моделирование процесса регенрации и получения жизнеспособных растений.

Важную роль в индукции деления клеток экспланта, образовании каллуса и морфогенезе играют фитогормоны. Они позволяют регулировать развитие эксплантовin vitroпутем изменения их концентрации и соотношения. Для большинства растений поиск гормональных компонентов среды имеет случайный харатер, когда необходимо проверить широкий диапозон концентраций и комбинаций фитогормонов в питательной среде для стимуляции и активации пролиферации, роста и развития эксплантов в культуре. Поэтому изучение комплекса эндогенных фитогормонов растений позволяет ускорить процесс оптимизации культивирования эксплантов in vitro.

Материалы и методы

Материалом для проведения исследований были следующие виды орхидных: Cephalantheradamasonium(Mill.) Druce), Himantoglossum caprinum (M. Bieb.) K. Koch, Ophrys oestrifera M. Bieb [4] (рис. 1).

                                                                        А                                             Б                                          В

Рис. 1.Cephalanthera damasonium (Mill.) Druce (А), Himantoglossum caprinum (M. Bieb.) K. Koch (Б), Ophrys oestrifera M. Bieb (В)

Экспедиционными исследованиями было охвачено центральный район главной горной гряды и западный район Южного берега Крыма. Для определения морфогенетического потенциала природного растительного материала в условиях invitro были использованы генеративные органы орхидей: семязачатки, завязи, пыльники. Сбор материала проводился с учетом законов биоэтики. В лабораторном эксперименте с культурой тканей экспланты культивировали на стерильних питательных середах: Мурасиге-Скуга (завязи), Нича и Нич (семязачатки и пыльники), Кнудсона С (стебель) [5]. В качестве эксплантов использовали вегетативне и генеративные органы орхидей, которые были отобраны в период вегетации (листя и стебли), в начале цветения (пыльники), и на 25-й день после опыления (завязи, семязачатки). Предварительно проводили поверхностную стерилизацию эксплантов стерилентами, подобранными для каждого типа экспланта, после чего их промывали стерильной дистилированной водой. Для пыльников использовали двойную стерилизацию 0,8 % Ag(NO3)2 и 70 % С2Н5ОН в течение 2 и 1 мин соответственно, для завязей – стерилизацию 80 % С2Н5ОН (1,5 мин) вместе с 15 % Н2О2 (2 мин), для стерилизации семязачатков – двойную стерилизацию 70 % С2Н5ОН (2 мин) вместе с 15 % Н2О2 (3 мин), для получения стерильной культуры из сегментов стебля - 0,1% HgCl2 с экспозицией 10 мин. К стерилизующему раствору добавляли эмульгатор Твин-20 (одну каплю на 100 мл раствора). Для удаления фенолов в воду для промывания эксплантов добавляли 7 % раствор L-цистеина, а процесс изоляции эксплантов проводили в стерильном растворе аскорбиновой кислоты на чашках Петри. Культивирование проводили в фотолюминостате ФСЛ-В (Россия) при 20–250С, 16-часовом фотопериоде с освещением 1000–3000 лк и 70 % относительной влажности воздуха и в термостате ВТ-120 (Польша) при температуре 250С и отсутствии освещения. Для индукции роста и поддержания культур тканей использовали индолилмасляную кислоту (ИМК), 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрациях от 0,5 мг/л до 3,0 мг/л (табл. 1).
 

Таблица 1. Варианты количественного соотношения экзогенных фитогормонов в питательных средах для культивирования генеративных органов орхидей invitro

Вариант питательной среды

Содержание экзогенных фитогормонов, мг/л

6-БАП

2,4-Д

ИМК

І

II

0,5

III

1,5

1,5

1,5

IV

2,0

1,5

V

2,0

VI

2,5

VII

3,0

VIII

2,5

1,5

IX

3,0

X

3,0

2,0

XI

2,5

 

В фиксированных образцах определяли количество индолилуксускной кислоты (ИУК), абсцизовой кислоты (АБК) и цитокининов (ЦТК) [9]. Фракцию гормонов выделяли 80%-ным этанолом, спирт упаривали. Водный остаток промораживали, центрифугировали при 10000 g, супернатант экстрагировали диэтиловым эфиром при рН 2,5 (ИУК и АБК) и бутанолом при рН 8 (ЦТК). Уровни связанных ИУК и АБК оценивали после химимческого гидролиза. Фракции ИУК и АБК очищали с помощью кислотно-щелочной переэкстракции и ТСХ на пластинах Silufol UV-254 (Kavalier, Чехия) в системе растворителей хлороформ:этилацетат:уксусная кислота (70:30:5). Очистку ЦТК проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке Дауэкс 50Wx8 (Н+ -форма, элюция аммиаком) и ТСХ в системе изопропанол:аммиак:вода (10:1:1). В качестве стандартов использовали препараты фитогормонов фирмы Sigma (США). Окончательный анализ качественного и количественного содержания фитогормонов проводился методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1200 LC c диодно-матричным детектором G 1315 В (США), колонка Eclipce XDB-С 18 2,1×150 мм, размер частиц 5 мм. Элюция проводилась в системе растворителей метанол:вода (37:63). Анализ и обработка хроматограмм проводилась с программным обеспечением Chem Station, версия В.03.01 в режиме online.

Все полученные результаты обрабатывали статистически с помощью компьютерной статистической программы Excel лицензионного пакета Microsoft Office 2007. В таблицах и на рисунках приведены средние арифметические и их статистические ошибки. Достоверность разницы оценивали по критерию Стьюдента, используя 5 % уровень значимости (Р≤0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Данные виды орхидей были выбраны в качестве объекта исследований не случайно. Повышенное внимание к орхидеям определяется не только их высокими декоративными качествами, но и уникальными особенностями биологии этих растений. Кроме этого, представители семейства почти повсеместно являются одним из уязвимых звеньев фитоценозов [1; 3; 10]. Без детального изучения орхидей и организации их эффективной научно обоснованной  сохранить наиболее редкие их виды во многих густонаселенных областях умеренной зоны невозможно.

Метод культуры клеток, тканей и органов растений решает проблему дифференциации и морфогенеза, поскольку клетки в условиях invitro лишены многих важных взаимодействий, которые контролируют эти процессы в целом организме. При этом создание разных условий культивирования invitro дает возможность изучать разные уровни организации высших растений и процессы дифференциации [2;3;5]. В наших исследованиях в качестве эксплантов были использованы листья, стебли, лепестки, завязи, семязачатки и пыльники орхидей. Для определения оптимальной стадии онтогенеза, на которой необходимо отбирать экспланты, учитывали данные,полученные при изучении содержания эндогенных фитогормонов. Учитывая соотношения ключевых фитогормонов, экспланты необходимо отбирать на стадии онтогнеза, для которой характерно максимальное содержание свободных форм ЦТК, ИУК и минимальное содержание свободной формы АБК [6;7;8]. Для листьев и стебля такой стадией, как видно на примере Hcaprinum(табл. 2), является вегетация, поскольку вегетативные органы в этот период характеризуются наибольшим содержанием гормонов индольной

 

Таблица 2. Фитогормоны вегетативных органов Himantoglossumcaprinumв онтогенезе

Органи растений

Сотношения эндогенных фитогормонов

Периоды онтогенеза

Вегетация

Цветение

Плодообразование

Стебли

ИУК/АБК

0,9

0,7

0,1

ЦТК/ ИУК

1,5

2,1

4,9

ЦТК/АБК

1,5

1,4

0,7

ИУК с/ ИУК св

1,1

2,5

18,7

ЦТК с /ЦТКсв

0,5

0,2

0,1

АБК с /АБКсв

0,2

0,5

2,4

Листья

ИУК /АБК

0,6

0,5

0,3

ЦТК/ ИУК

0,7

0,4

1,0

ЦТК/АБК

0,4

0,2

0,2

ИУК с / ИУК св

0,8

2,0

2,3

ЦТК с /ЦТКсв

0,9

0,7

0,1

АБК с /АБКсв

1,1

1,2

10,1

Примечание: с – свободная форма, св – связанная форма фитогормонов

природы и цитокининов. Не смотря на то, что листья харатеризуются повышенным содержанием АБК, именно в этот период они содержали максимальные уровни цитокининов, которую играют важную роль в делении клеток и каллусогенезе.

По результатам проведенного скрининга ряда показателей для введения в культуру invitroбыли отобраны жизнеспособные экспланты оптимального размера, полученные из стебля и завязей, семязачатков и пыльников, которые сохраняли стерильность и пролиферировали. Жизнеспособные экспланты лепестков и листьев при данных условиях е пролиферировали, поэтому для введения в культуру invitroне использовались.

Главную роль в индукции деления клеток экспланта, образовании каллуса и морфогенезе играют фитогормоны, которые являются неотьемлемой частью

микроклонального размножения растений [11;12;13]. Перед подбором оптимальных концентраций и соотношений фитогормонов в питательной среде для культивирования эксплантов предварительно провели исследования содержания фитогормонов в интактных органах. Исследования по подбору оптимальных концентраций и соотношений фитогормонов в питательной среде показали на примере эксплантов из завязей, что максимальная частота каллусогенеза наблюдается на питательных средах, в которых сохраняется такое же соотношение цитокининов и ауксинов, как и для интактного органа. У O. oestrifera максимальная частота каллусогенеза наблюдается при культивировании на питательной среде с добавлениием экзогенных цитокининов и ауксинов в соотношении 1,7, что характерно для интактных органов (табл. 3). Для эксплантов завязей H caprinumтакое соотношение фитогормонов составило 1,5, а для C. damasonium– 1,5.

 

Таблица 3. Зависимость каллусогенеза эксплантов завязей орхидных от соотношения эндогенных и экзогенных цитокининов и ауксинов

Цитокинины/ауксины

Частота каллусогенеза, %

Эндогенные

Экзогенные

Ophrys oestrifera

1,7

1,7

29,9 ± 1,5

1,7

1,3

1,3 ± 0,1

1,7

0,7

5,4 ± 0,3

1,7

0,5

3,0 ± 0,2

Himantoglossum caprinum

1,5

1,5

34,6 ± 1,7

1,5

1,3

3,0 ± 0,1

1,5

0,7

3,8 ± 0,2

1,5

0,5

1,9 ± 0,1

Cephalantheradamasonium

1,5

1,5

23,9 ± 1,1

1,5

1,3

4,0 ± 0,1

1,5

0,7

3,6 ± 0,3

1,5

0,5

0,9 ± 0,01

При культивировании на питательных средах с другими количественными соотношениями фитогормонов частота каллусогенеза была значительно меньше и не превышала для всех типов эксплантов 10 % (рис. 2)

 

Рис. 2. Интенсивность каллусогенеза из эксплантов завязей (А) и стебля (Б) орхидных на питательных средах с разным соотношением экзогенных цитокининов и ауксинов: 

Результаты работы расширяют представление о роли фитогормонального комплекса вегетативных и генеративных органов растений в процессах роста и развития и могут служить основой для разработки эффективных методов размножения редких орхидных в культуре invitro при помощи экзогенных регуляторов роста. Кроме того, полученные данные указывают на перспективность применения методов микроклонального размножения редких и исчезающих видов растений, в частности орхидей, и могут быть использованы для сохранения генофонда орхидных.

Выводы

  1. Впервые установлена взаимосвязь интенсивности каллусогенеза из эксплантов вегетативных и генеративных органов орхидных и соотношения составляющих фитогормонального комплекса на определенных этапах онтогенеза, что необходимо учитывать при разработке методов микроклонального размножения этих видов.
  2. Показано, что максимальная частота каллусогенеза в определенных условиях культивирования характерна для генеративных органов орхидей, которые отличаются повышенным содержанием цитокининов, индолилуксусной кислоты и низким уровнем абсцизовой кислоты.
  3. Установлено, что максимальная частота каллусогенеза для эксплантов из генеративных и вегетативных органов орхидных наблюдается на питательных средах с подобным соотношением экзогенных и эндогенных фитогормонов.

Библиографический список:

1. Красный список особо охраняемых редких и находящихся под угрозой исчезновения животных и растений (2-й выпуск). Часть 3.2. Семенные растения [ответ. ред. В.Е. Присяжнюк]. – М., 2004. – 360 с.
2. Круглова Н.Н., Дубровная О.В. Морфогенез андроклинных каллюсов злаков in vitro // Физиология и биохимия культ. растений. – 2011. – 43, № 1. – С. 15–25.
3. Теплицкая Л.М., Попкова Л.Л., Бугара А.М., Котов С.Ф. Сохранение растительного генофонда орхидных Крыма методом культивирования in vitro // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана. – Симферополь, 2002. – Вып. 12. – С. 39 – 43.
4. Червона книга України. Рослинний світ / [за ред. Я.П. Дідуха]. – К.: Глобалконсалтинг, 2009. – 900 с.
5. Черевченко Т.М., Лаврентьева А.Н., Иванников Р.В. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro. – К.: Наук. думка, 2008. – 560 с.
6. Bajguz A, Piotrowska A. Conjugates of auxin and cytokinin // Phytochemistry. – 2009. – Vol. 70, N 8. – P. 957–969.
7. Philip J. Kauth, Michael E. Kane, Wagner A. Vendrame. Asymbiotic germination response to photoperiod and nutritional media in six populations of Calopogon tuberosus var. tuberosus (Orchidaceae): evidence for ecotypic differentiation // Ann. Bot. – 2008. – N 102. – P. 783–793.
8. Иванова А.Б. Современные аспекты изучения фитогормонов. Цитокинины / А.Б. Иванова, Л.Л. Анцигина, А.Ю. Ярин // Цитология. – 2001. – № 6. – С. 537–544.
9. Методические рекомендации по определению фитогормонов. – К., 1988. – 78 с. – (Препринт, Институт ботаники)
10. Собко В.Г. Стежинами Червоної книги / Собко В.Г. – К.:Урожай, 2007. – 280 с.
11. Regulation of plant growth by cytokinin / [T. Werner, V. Motyka, M. Strnad, T. Schmülling] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – Vol. 98. – P. 10487–10492.
12. Role of hormonal regulation of auxin and cytokinin in lateral root development / [E. Benkova, A. Chist, J. Triml, G. Jugens] // XV Congress Federation of European Societies of Plant Biology (17–21 July 2006), Lyon, France. – 2006. – P. 117.
13. Van Staden J. Occurrence and potential physiological effects of algae plant growth regulators / J. Van Staden // Intern. Workshop and Training Course on Microalgal Biology and Biotechnology (Mosonmagyarovar, Hungary, 18–20 June 1999) – Hungary, 1999. – P. 40.




Рецензии:

22.09.2013, 19:34 Остапенко Ольга Валериевна
Рецензия: Рецензия на статью Шейко Елены Анатолиевны Гормональный комплекс растений как один из основополагающих факторов успешного введения в культуру in vitro Актуальность статьи не вызывает сомнений, т.к. фитогормоны играют важную роль в индукции деления клеток экспланта, образовании каллуса и морфогенезе. Применение фитогормонов позволяет регулировать развитие эксплантов in vitro путем изменения их концентрации и соотношения. В статье приводятся данные исследования количественного соотношения экзогенных фитогормонов в питательных средах для культивирования генеративных органов орхидей invitro, а также зависимость каллусогенеза эксплантов завязей орхидных от соотношения эндогенных и экзогенных цитокининов и ауксинов Автор статьи впервые установила взаимосвязь интенсивности каллусогенеза из эксплантов вегетативных (стебель, листья) и генеративных (завязи, семязачатки и пыльники) органов орхидных и соотношения составляющих фитогормонального комплекса на определенных этапах онтогенеза. Полученные данные необходимо учитывать при разработке методов микроклонального размножения видов орхидей: Cephalanthera damasonium (Mill.) Druce, Himantoglossum caprinum (M. Bieb.) K. Koch, Ophrys oestrifera M. Bieb. Таким образом, авторами показано, что максимальная частота каллусогенеза в определенных условиях культивирования характерна для генеративных органов орхидей, которые отличаются повышенным содержанием цитокининов, индолилуксусной кислоты и низким уровнем абсцизовой кислоты. Установлено, что максимальная частота каллусогенеза для эксплантов из генеративных и вегетативных органов орхидных наблюдается на питательных средах с подобным соотношением экзогенных и эндогенных фитогормонов. Статья заслуживает особого внимания со стороны научного общества. к.мед.н, Остапенко О.В.

14.10.2013, 22:10 Сорокопудов Владимир Николаевич
Рецензия: Шейко Еленой Анатольевной проведена интересная научная работа, результаты которой расширяют представление о роли фитогормонального комплекса вегетативных и генеративных органов растений в процессах роста и развития и могут служить основой для разработки эффективных методов размножения редких орхидных в культуре in vitro при помощи экзогенных регуляторов роста. Кроме того, полученные данные указывают на перспективность применения методов микроклонального размножения редких и исчезающих видов растений, в частности орхидей, и могут быть использованы для сохранения генофонда орхидных. Считаю, что данная работа является очень перспективной и рекомендуется к открытой печати. Рецензент: академик АНИРР, доктор с.-х.наук, профессор В.Н.Сорокопудов

12.11.2013, 16:29 Бозоров Бахритдин Махаммадиевич
Рецензия: Статья является очень перспективной и интересной рекомендуется к открытой печати. Рецензент: к.б.н. доцент Б.М.Бозоров

18.12.2013, 12:48 Дудоладова Татьяна Сергеевна
Рецензия: Автором проведена научная работа, актуальность которой не вызывает сомнения. В статье представлены результаты математической обработки результатов исследований. Результаты работы расширяют представление о роли фитогормонального комплекса вегетативных и генеративных органов растений которые могут служить основой для разработки эффективных методов размножения редких орхидных в культуре in vitro при помощи экзогенных регуляторов роста, а также метод микроклонального размножения редких и исчезающих видов растений могут быть использованы для сохранения генофонда орхидных. После выше сказанного статью рекомендую к открытой печати. Рецензент: к.б.н. Т.С. Дудоладова.

29.09.2014, 16:58 Киселева Наталья Станиславовна
Рецензия: В статье Шейко Е.А."Гормональный комплекс растений как один из основополагающих факторов успешного введения в культуру in vitro" показана интересная научная работа о роли фитогормонального комплекса вегетативных и генеративных органов растений в процессах роста и развития.Автором впервые установлена взаимосвязь интенсивности каллусогенеза из эксплантов вегетативных и генеративных органов орхидных и соотношения составляющих фитогормонального комплекса на определенных этапах онтогенеза.Полученные результаты могут стать основой для разработки эффективных методов размножения редких орхидных в культуре in vitro при помощи экзогенных регуляторов роста и подтверждают перспективность применения методов микроклонального размножения орхидей, в том числе - для сохранения генофонда орхидных. Желательно было бы проведение одно- и двухфакторного дисперсионного анализа (показать долю влияния каждого фактора и их взаимодействия)для большей статистической достоверности и наглядности. Таким образом, работа стала бы еще глубже. Тем не менее считаю, что данная научная работа, несомненно, весьма перспективна, рекомендуется к печати. Рецензент: к.б.н Киселева Н.С.

6.03.2015, 19:19 Аскарходжаев Нодир Ахмедович
Рецензия: Статья является весьма актуальной имеет теоретический интерес и практическую ценность. Рекомендуется к открытой печати. Рецензент: к.б.н. доцент Н.А.Аскарходжаев



Комментарии пользователей:

6.10.2013, 15:42 Назарова Ольга Петровна
Отзыв: Не понятно, почему не использован однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ, чтобы пказать влияние факторов и долю влияния факторов для каждого эксперимента. ряд неточностей: "с помощью компьютерной статистической программы Excel"," приведены средние арифметические и их статистические ошибки" -выборочные средние и стандартные отклонения.


7.11.2013, 1:22 Хабиев Гаджимурад Наибсултанович
Отзыв: "Экспедиционными исследованиями было охвачено центральный..." ...был охвачен или были охвачены


Оставить комментарий


 
 

Вверх