Статья опубликована в №5 (январь) 2014
Разделы: Медицина
Размещена 29.01.2014. Последняя правка: 28.01.2014.
Просмотров - 3440

ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ ГЕНОВ ПАТОГЕННОСТИ, АССОЦИИРУЕМЫХ С ШИГА-ПОДОБНЫМИ ТОКСИНАМИ У АУТОШТАММОВ ESCHERICHIA COLI В ЗАВИСИМОСТИ ОТ МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА КИШЕЧНОГО БИОТОПА

Иванова Елена Иннокентьевна

к.б.н.

ФГБНУ "НЦ ПЗСРЧ"

ведущий научный сотрудник

Джиоев Юрий Павлович (ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и генодиагностики, к.б.н.); Попкова София Марковна (ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН, заведующая лабораторией микроэкологии, д.б.н.); Ракова Елена Борисовна (ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН, научный сотрудник лаборатории микроэкологии, к.б.н.); Рычкова

УДК 579.842.11, 616.093

Кишечные палочки являются по существу комменсалом человека и важным атагонистическим фактором для гнилостных микроорганизмов, ограничивающим их развитие в кишечнике [1, 2]. E.coli играет, безусловно, положительную роль в процессе пищеварения, витаминном балансе, а также в создании местного, кишечного, иммунитета. Большое значение имеет она и в построении общего иммунитета, предполагающего выработку специфических и неспецифических антител. Однако при известных обстоятельствах этот вид микроорганизма способен вызвать различные патологические состояния: колиты, энтериты, циститы, холециститы, сепсис. Иными словами, существует возможность превращения симбиозов нормально биологических в симбиозы патологические. Условно-патогенные микроорганизмы начинают играть роль паразита в том случае, если после окончания заболевания у макроорганизма не установятся с ним вновь симбиотические взаимоотношения [3].

Для эшерихий патогенность не является видовым признаком и не связана с конкретной серогруппой. Они способны реализовать свой патогенный потенциал и вызывать нарушения в организме человека, ограниченные только теми генетическими детерминантами, которыми обладает конкретный штамм E.coli[4].

К появлению новых вариантов E.coliведет обмен разных типов бактерий между собой и с другими представителями сем.Enterobacteriaceae мобильными генетическими элементами. Один из таких вариантов – продуцирующие шигатоксины штаммы E. coli (STEC). Энтерогеморрагические штаммы E. coli (EHEC) представляют собой группу штаммов STEC, способных вызывать у людей геморрагическую диарею и гемолитический уремический синдром [2].

В связи с этим, цель исследования – выявление генов, кодирующих способность к шигатоксинообразованию у разных фенотипических вариантов E.coliна фоне сопутствующей микробиоты кишечника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На дисбиоз кишечника обследовано 225 детей (от рождения до 15 лет) с функциональными нарушениями (ФН) желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (абдоминальный синдром, расстройства дефекации, расстройства билиарного тракта в течение более 12 недель). При микробиологическом анализе копрологической пробы использовали общепринятый метод [5]. Для исследования были выделены разные типы E.coli: с нормальной ферментативной активностью (202 аутоштаммов),со слабой ферментативной активностью (60 аутоштаммов) и с гемолитической активностью (24 аутоштаммов). По культурально-ферментативным свойствам и антигенным характеристикам исследуемые штаммыE.coliявлялись типичными представителями индигенной микрофлоры рода Escherichia. Всего исследовано 286 культурE.coli.

Выделение тотальной ДНК проводили, амплификацию, электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов осуществляли по ранее описанным методикам [6]. Штаммы E.coli подвергались генетическому исследованию методом ПЦР по наличию/отсутствию генов патогенности, кодирующих способность к шигатоксинообразованию (stx1 и stx2). Реакцию проводили с применением опубликованных праймеров и протокола реакции амплификации [6, 7].

Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в 1% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием. В качестве буферной системы использовали трис-ацетатный буфер. Электрофорез проводили при следующем режиме: 100 В, 50 мА, 40-50 мин. В качестве маркера использовали O’RangeRuler 100 bpDNALadder («Fermentas», Литва), в качестве отрицательного контроля использовали реакционную смесь, не содержащую ДНК. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете и документировали с помощью программы inVCR на трансиллюминаторе UVT 1 biokom.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам бактериологических исследований копрологических проб почти у всех детей с ФН ЖКТ диагностированы нарушения состава нормальной микробиоты толстой кишки различной степени выраженности. Дисбаланс облигатной микробиоты в основном характеризовался снижением популяционного уровня на 1-3 порядка представителей индигенных бактерий (73,3±2,94%). Дефицит бифидобактерий выявлен в 55,5±3,31%, лактобацилл – в 1,3±0,75% и E.coli с нормальными ферментативными свойствами – в 16,4±2,46%. На фоне дефицита представителей облигатной микробиоты в микроэкологической системе кишечника отмечалась вегетация различных условно-патогенных микроорганизмов в значительном количестве.

     В целом иерархия бактериального сообщества в изучаемой группе была четко выражена. Спектр кишечной микробиоты обследованных детей был представлен различными видами микроорганизмов с частотой встречаемости (%): для Enterococcus spp. – 71,6%, Klebsiella spp. – 37,3%, E.coli со слабой ферментативной активностью – 27,1%, Staphylococcus spp. – 24,0%, Clostridium spp. – 17,3%, Candida spp. – 15,1%, E.coli с гемолитической активностью – 11,6%, Enterobacter spp. – 9,7%, Citrobacter spp. – 4,4%, Pseudomonas spp. – 3,1% и Proteus spp. – 1,8%.

У большей части детей (66,2%) в кишечном биотопе выявлялись условно-патогенные микроорганизмы (УПМ). В монокультуре представители условно-патогенной микробиоты встречались в 31,6% случаев. В большинстве случаев обнаруживались двухкомпонентные системы (25,3%). Ассоциации, состоящие из трех и четырех ассоциантов образовывались крайне редко (7,1% и 2,2%, соответственно).

Из 286 образцов ДНК, выделенных из аутоштаммов культур E.coli и исследованных в ПЦР, 32 пробы (11,2±1,8%) оказались положительными на наличие гена stx1, 14 (5,0±1,3%) – на наличие гена stx2.

Данные гены патогенности, чаще присутствовали в геноме E.coli с нормальной ферментативной активностью, вегетирующей в биотопе детей с ФН (stx1 – 12,9±2,4%, stx2 – 5,0±1,5%) по сравнению с атипичными ее формами. Для форм со слабой ферментативной активностью stx1 определялся в 8,3±3,5%, stx2 в 5,0±2,8%; для форм с гемолитической активностью stx1 – 4,2±4,0%, stx2 – 4,2±4,0%.

Частота распространения генов анализировалась в зависимости от микроэкологического статуса кишечного биотопа. Нами было отмечено, что как в условиях эубиоза так и в условиях нарушения микроэкологического равновесия (при дефиците лакто- и бифидобактерий, вегетации условно-патогенной биоты) веротоксины двух типов (1 и 2 тип) выявлялись в геноме E.coli с разной частотой. Так при микроэкологической норме выявляемость stx1 была в 2 раза ниже по сравнению stx2.

При дефиците индигенной микробиоты наличие как веротоксина 1, так и веротоксина 2 регистрировалось в 3 раза чаще, чем при эубиозе (6,7% и 20,0% соответственно для stx1,и 14,2% и 42,9% для stx2). Однако при этом, доля аутоштаммов с stx2 значительно преобладала над штаммами с stx1. В условиях же более глубокого микроэкологического дисбаланса в кишечном биотопе, с вегетацией условно-патогенных микроорганизмов в диагностически значимых титрах, соотношение аутоштаммов с определяемыми веротоксинами менялось на противоположное. При этом доля аутоштаммов с stx1 резко возрастала до 73,3% (от 6,7% при эубиозе, p<0,05), а доля аутоштаммов с stx2 оставалась на том же уровне, как и при дефиците индигенной биоты (42,9%). В этом случае доля аутоштаммов с наличием в геноме эшерихий гена stx1, контролирующего синтез менее токсичного веротоксина, была значительно выше (73%), чем в условиях только дефицита индигенной микробиоты (20%, p<0,05). Таким образом, с нарастанием микроэкологического дисбаланса в кишечном биотопе детей с ФН, во-первых растет доля аутоштаммов с наличием определяемых генов, а, во-вторых, при значительном дисбалансе кишечной микробиоты значительное преимущество получают эшерихии с наличием stx1 над stx2.

Выявленные в данной работе гены патогенности, наличие которых характерно для диареегенных эшерихий, позволяет считать их возбудителями инфекций кишечника человека.

Наиболее интересным фактом в данной работе является выявление веротоксинов (1 и 2 типа) в аутоштаммах типичных E.coli. Так острые кишечные инфекции, обусловленные вегетацией шигатоксин-продуцирующими кишечными палочками (STEC) различных серогрупп, включая E.coli О157:Н7, регистрируются практически повсеместно [8]. Однако, кроме E.coli О157:Н7, в группу шигатоксин-продуцирующих штаммов E.coli включают большее количество шигатоксин-продуцирующих кишечных палочек других серотипов, частота встречаемости и генетическая характеристика которых на территории РФ практически не изучена [9]. Интерес научной и практической медицинской общественности к шигатоксин-продуцирующим E.coli резко возрос в 2011 году, когда Германия пережила крупнейшую вспышку STEC - случаев за всю историю [10, 11]. Как показали эпидемиологические и генетические исследования, штаммы, выделенные при этой вспышке, относились к энтероагрегативной геморрагической кишечной палочке (EAHEC) O104: H4, продуцирующей шига-токсин 2 (stx2). Расшифровка последовательностей генома возбудителя показала, что произошла клональная вспышка EAHEC, в штаммах которых носителями факторов вирулентности являлись плазмида pAA и умеренные лямбдовидные фаги. Предполагается, что из неизвестного источника эпидемические штаммы приобрели лямбдовидный профаг, несущий ген шига токсина, и одновременное обладание двумя этими мобильными элементами могло способствовать существенному повышению факторов вирулентности EAHEC [10, 12, 13].

Поэтому регистрация веротоксинов должна определяться совокупно с другими генами патогенности.

Штаммы с наличием исследуемых генов, выявленные при эубиозе кишечной биоты, по всей видимости, способны к персистенции в кишечнике человека без развития патологического процесса, но могут быть потенциальными возбудителями, например, урологических заболеваний.

Изучение микроэкологических параметров нормальной микробиоты кишечника позволяет предупредить развитие различных заболеваний, связанных с дисбиотическими нарушениями, а так же уменьшить их неблагоприятное влияние на здоровье человека.

Обнаружение генетических детерминант stx1 и stx2 позволяет обсуждать наличие потенциальной патогенности данных аутоштаммов E.coli и участие их в усугублении функциональных нарушений ЖКТ, прогнозировать появление штаммов с новыми свойствами. Что говорит о важности проведения дифференциальной молекулярно-генетической диагностики штаммов E.coli даже в случаях отсутствия явных микробиологических нарушений, но с функциональными нарушениями ЖКТ.

Глобальное распространение STEC является новой угрозой для здоровья людей, в большей мере проживающих в развитых странах, где массовое применение лекарственных препаратов и антибиотиков способствуют формированию новых патотипов в тех микробных сообществах, которые ранее были в большей мере комменсалами и мутуалистами.

1. Ильина Н.А., Карпеева Е.А., Гусева И.Т. E. coli как условно-патогенные бактерии кишечника человека // Современные наукоемкие технологии. – 2008. – № 9. – С. 60–62.
2. Шуляк Б.Ф. Энтерогеморрагические штаммы E.coli. Обзор // Альманах клинической медицины. – 2011. – № 25. – С. 72–76.
3. Crump J.A., Mendoza C.E., Priest J.W., Glass R.I., Monroe S.S., Dauphin L.A., Bibb W.F., Lopez M.B., Alvarez M., Mintz E.D., Luby S.P. Comparing serologic response against enteric pathogens with reported diarrhea to assess the impact of improved household drinking water quality // Am J Trop Med Hyg. – 2007. – V. 77. – P. 136–141.
4. Лайман Е.Ф., Шаркова В.А., Мазур М.Е., Просянникова М.Н.Молекулярно-генетическая характеристика факторов патогенности E.coli, выделенных из операционных ран различных классов // Междунар. журн.эксперимент. образования, 2012. – № 5 – С. 84–85.
5. Отраслевой стандарт ОСТ 91500.11.0004-2003. Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». Утв. 09.06.03.
6. Выявление генов патогенности, кодирующих способность к токсинообразованию, у штаммов Escherichia coli, выделенных из кишечного биотопа детей / Е.И. Иванова, С.М. Попкова, Ю.П. Джиоев, Е.Б. Ракова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – 2013. – № 2(90), Ч. 2. – С. 111–114.
7. Blanco M., Blanco J. E., Mora A., Rey J., Alonso J. M., Hermoso M., Hermoso J., Alonso M. P., Dahbi G., González E. A., Bernárdez M. I., Blanco J. Serotypes, Virulence Genes, and Intimin Types of Shiga Toxin (Verotoxin)-Producing Escherichia coli Isolates from Healthy Sheep in Spain // Journal of clinical microbiology. – 2003. – V. 41. – № 4. – P. 1351–1356.
8. Gyles C.L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: an overview // J.Anim.Sci. – 2007. – № 85. – P. E45–E62.
9. Шабанова Н.А., Бондаренко В.М. Различия по набору генов патогенности у штаммов Escherichia coli, продуцирующих шига-подобные токсины // Журн. микробиол. – 2009. – № 5. – С. 4–8.
10. Muniesa M., Hammerl J.A., Hertwig S., Appel B., Brüssow H. Shiga Toxin-Producing Escherichia coli O104:H4: a New Challenge for Microbiology // Appl Environ Microbiol. –2012. – № 78 (12). – P. 4065–4073.
11. Beutin L., Martin A. Outbreak of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O104:H4 infection in Germany causes a paradigm shift with regard to human pathogenicity of STEC strains // J Food Prot. –2012. – № 75 (2). – P. 408–418.
12. Fogg P.C., Saunders J.R., McCarthy A.J., Allison H.E. Cumulative effect of prophage burden on Shiga toxin production in Escherichia coli // Microbiology. – 2012. – № 58 (Pt 2) – P. 488-497.
13. Melton-Celsa A., Mohawk K., Teel L., O'Brien A. Pathogenesis of Shiga-toxin producing Escherichia coli // Curr Top Microbiol. Immunol. –2012. – № 357. – P. 67–103.

Рецензии:

30.01.2014, 11:59 Лахтин Юрий Владимирович
Рецензия: Классическая академическая работа. Статья выдержана в научном стиле. Задачи поставлены, результаты и выводы работы согласуются с ними. Рекомендую к публикации в журнале.

16.07.2014, 15:50 Остапенко Ольга Валериевна
Рецензия: Рекомендую статью к публикации в журнале.



Комментарии пользователей:

Оставить комментарий