Статья опубликована в №45 (май) 2017
Разделы: Медицина
Размещена 20.05.2017. Последняя правка: 26.05.2017.
Просмотров - 2121

Оценка влияния полиморфизма генов системы гемостаза и генов, отвечающих за формирование дисфункции эндотелия, в развитии гестационных осложнений

Чуманова Ольга Владимировна

Новосибирский государственный университет

студент

Воронина Елена Николаевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник Института Химической Биологии и Фундаментальной Медицины

УДК 618.3-06

Актуальность

Повышенное тромбообразование и нарушение тонуса маточно-плацентарных сосудов в акушерской практике является одной из значимых причин развития осложнений беременности. Различают наследственные и приобретенные факторы риска развития этих осложнений.

 К первой группе относятся наследственные формы тромбофилии и генетически обусловленная дисфункция эндотелия, которые, согласно литературным данным, имеют место в патогенезе более 30% всех гестационных осложнений [1,2, с.6]. В эту группу попадают наиболее грозные, определяющие четверть в структуре материнской смертности: преэклампсия, эклампсия и отслойка плаценты [3, с.6]. 

Все исследуемые осложнения ьвляются следствием снижения кровотока в маточно – плацентарных сосудах, приводя к нарушению имплантации, плацентации и дальнейшего развития плодного яйца.

Целью работы являлось определение роли следующих полиморфизмов в развитии осложненного течения беременности: G20210A FII, rs1799963; G1691A FV, rs6025; 5G/4G 675 PAI-1, rs1799768; C677T MTHFR, rs1801133; G634C VEGF, rs2010936; Glu298Asp еNOS, rs1799983.

Материалы и методы

Для проведения исследования были выбраны следующие группы: основная группа (n=257) и контрольная (n=190). В первую группу включались женщины с патологией беременности (преэклампсия, преждевременная отслойка плаценты, декомпенсированная фетоплацентарная недостаточность, синдром потери плода). Для устранения других причин развития гестационных осложнений были установлены критерии исключения из экспериментальной группы: врожденные пороки развития репродуктивной системы, тяжелая урогенитальная инфекция, декомпенсация хронических экстрагенитальных заболеваний, эндометриоз, миома матки, аномалии хромосомного набора плода при проведении кариотипирования, антифосфолипидный синдром.

В группу контроля вошли здоровые женщины, родившие живого доношенного ребенка с оценкой по шкале Апгар 8–10 баллов и не имеющие акушерской патологии.  Предпочтение отдавалось женщинам, имеющим двух и более детей.

Все женщины, включенные в исследуемые группы были пациентками лечебно-диагностического центра - ООО «Клиника профессора Пасман» города Новосибирска. Генотипирование проводилось на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

В обеих группах проводился забор венозной крови. ДНК выделяли методом фенол – хлороформной экстракции с последующим осаждением этанолом [4, с.6].

Типирование полиморфных локусов G20210A FII, G1691A FV, 5G/4G 675 PAI-1, C677T MTHFR, G634C VEGF, Glu298Asp еNOS проводили методом ПЦР в режиме реального времени с использованием технологии конкурирующих TaqMan-зондов. Общий объем реакционной смесисоставлял 25 мкл, содержащей 40-100 нгДНК, 300 нМ прямого и обратного праймера (представлены в табл.1); по 100 нМTaqMan-зондов, коньюгированных с FAM или HEX; 200 мкМdNTP, амплификационный буфер, термостабильную Taq-полимеразу – 1 ед. акт. /реакц. Амплификация проводилась с помощью амплификатора CFX-96 (Bio-Rad, США) в следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 96°С; затем 50 циклов, включающих денатурацию при 96°С – 8 сек, отжиг праймеров и последующую элонгацию при 60°С – 40 сек. [5,6, с.7]. Интерпретацию результатов проводили с помощью анализа графиков накопления флюоресценции по соотношению значений флюоресценции в диапазонах эмиссии красителей FAM и HEX.

Таблица 1. Структуры праймеров для проведения генотипирования

Ген	Полиморфный локус	Последовательность праймеров
		Прямой	Обратный
FII	G20210A	5’-GGTTCCCAATAAAAGTGACTCTCATC-3’	5’-CATCTTTAATGCCTGTAAATTCGAC-3’
FV	G1691A	5’-GTAAGAGCAGATCCCTGGACAGTC-3’	5’-GCAGTGATGGTACTGATAAAAATCG-3’
MTHFR	C677T	5’-GTTACCCCAAAGGCCACCC-3’	5’-GGAAGAATGTGTCAGCCTCGAAG-3’
PAI-1	5G/4G 675	5’-TGCAGCCAGCCACGACGTGATTGTCTA-3’	5’-AAGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3’
VEGF	G634C	5’-CTTGCCTTGCTGCTCTACC-3’	5’-CACACAGGATGGCTTGAAG-3’
еNOS	Glu298Asp	5’-TGGCTGGTACATGAGCACTGAGAT-3’	5’-CACGTTGATTTCCACTGCTGCCTT-3’

Соответствие частот генотипов равновесию Харди – Вайнберга проверяли с помощью критерия χ². Достоверность различий частот аллелей и генотипов в исследуемых группах оценивали с помощью критерия χ² с учетом поправки Йетса. Статистически значимыми считались различия при р<0,05. Для оценки величины относительного риска использовали отношение шансов (OR) с его доверительным интервалом (C.I.) при уровне доверия 95 %. Вычисления производили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия,).

Результаты и обсуждение

Частоты встречаемости генотипов всех исследуемых полиморфизмов соответствуют закону Харди – Вайнберга и представлены в табл.2.

Таблица 2. Частоты аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов в экспериментальных и контрольных группах

Группа	Частота встречаемости аллеля (n)		Частота встречаемости генотипа (n)			Соответствие закону Харди-Вайнберга (χ², df=1), р (Pearson)
Полиморфный локус G20210A гена II фактора
	G	A	G/G	G/A	A/A
Контроль	0,989(376)	0,011  (4)	0,979(186)	0,021 (4)	0,005 (0)	0.883417
Группа риска	0,963 (495)	0,037 (19)	0,934 (240)	0,058 (15)	0,0078 (2)	0.3862
Полиморфный локус G1691А гена V фактора
	G	A	G/G	G/A	A/A
Контроль	0,984 (374)	0,016 (6)	0,968 (184)	0,032(6)	0 (0)	0.824988
Группа риска	0,965 (496)	0,035 (18)	0,934 (240)	0,062 (16)	0,004 (1)	0.206190
Полиморфный локус С677T гена MTHFR
	С	Т	С/С	С/Т	Т/Т
Контроль	0,679 (258)	0,321  (122)	0,468 (89)	0,421 (80)	0,111 (21)	0.63749
Группа риска	0,621 (319)	0,379 (195)	0,389 (100)	0,463 (119)	0,148 (38)	0.788879
Полиморфный локус  675 5G/4G гена PAI-1
	5G	4G	5G/5G	5G/4G	4G/4G
Контроль	0,684 (260)	0,316 (120)	0,474 (90)	0,421 (80)	0,105 (20)	0.723761
Группа риска	0,572 (294)	0,428 (220)	0,337 (87)	0,465 (120)	0,194 (50)	0.457141
Полиморфный локус G634C гена VEGF
	G	C	G/G	G/C	C/C
Контроль	0,792 (301)	0,208(79)	0,621 (118)	0,342(65)	0,037 (7)	0.593425
Группа риска	0,731 (377)	0,269 (139)	0,531 (137)	0,399(103)	0,070 (18)	0.819370
Полиморфный локус  Glu298Asp гена eNOS
	Glu	Asp	Glu/Glu	Glu/Asp	Asp/Asp
Контроль	0,721 (274)	0,279 (106)	0,521 (99)	0,400 (76)	0,079 (15)	0.937961
Группа риска	0,679 (349)	0,321 (165)	0,444 (114)	0,471 (121)	0,085 (22)	0.199454

Мутация гена протромбина G20210A

Для гена II фактора нами были обнаружены статистически значимые различия между контрольной и экспериментальной группой в частотах встречаемости аллелей (χ²=6,09; p=0,01357). Риск развития акушерской патологии при наличии аллеля А, приводящего к возрастанию концентрации протромбина в крови в несколько раз, увеличивается в 3,3 раза (OR=0,179; C.I.=0,056-0,569) [7, с.7]. Частоты встречаемости мутации протромбина в обеих группах выше среднепопуляционных. Это может быть обусловлено тем, что в популяционных исследованиях используется смешанная выборка из мужчин и женщин, и не проводится какой-либо отбор по наличию/отсутствию заболеваний.

Мутация Лейдена G1691А гена V фактора свертывания крови заключается в замене гуанина на аденин в позиции 1691. Она приводит к резистентности V фактора к расщепляющему действию протеина С, в результате чего уменьшается скорость инактивации протромбиназного комплекса и возрастает количество тромбина [8, с.7]. Ассоциаций между наличием этой мутации и развитием гестационных осложнений выявлено не было. В данной работе исследуемая группа состояла из женщин с различными нарушениями протекания беременности. При выделении подгруппы с преэклампсией, состоящей из 98 женщин, было показано, что при наличии мутации Лейдена риск развития преэклампсии возрастает в 3,4 раза (χ²=5,94; p=0,01478; O.R.=3,351; C.I.=1,200-9,362). Это подтверждает литературные данные: по данным метаанализа из 47 статей была установлена ассоциация лейденской мутации с развитием тяжелой и умерненной преэклампсии [9, с.7].

Полиморфный локус С677T гена MTHFR

MTHFR является ключевым ферментом фолатного цикла, приводя к образованию активной формы фолиевой кислоты. Аллель Т локуса С677T гена MTHFR, наличие которого приводит к снижению активности фермента метилентетрагидрофолатредуктазы, вызывает повышение уровня гомоцистеина в крови, что приводит к повреждению эндотелия и нарушению микроциркуляции [10,11, с.7]. Однако в нашем исследовании было показано, что полиморфный локус С677T гена MTHFR не приводит к развитию акушерской патологии.

Полиморфный локус 675 5G/4G гена PAI-1

Для гена PAI-1 статистически значимые различия между группами наблюдались в распределении как аллелей (χ²=11.68; p=0.00063), так и генотипов (χ²=8,34; p=0.00387). Для женщин, имеющих генотип 4G/4G, риск развития осложнений по сравнению с генотипом 5G/5G увеличивается в 2,6 раз (O.R.=2,586; C.I.=1,424-4,696), в то время как у гетерозигот – в 1,8 раз. Развитие осложнений связывают с тем, что присутствие аллели 4G сопровождается повышением экспрессии гена и увеличением концентрации PAI-1 в крови, что приводит к снижению активности системы фибринолиза и увеличению содержания фибрина в сосудистом русле, в том числе и в маточно - плацентарных сосудах [12, с.7].

Полиморфный локус G634C гена VEGF

Для гена сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF) было показано наличие ассоциаций аллели С с развитием патологического течения беременности (χ²=4,49; p=0.03402). Это наблюдается за счет развития вазоконстрикции, повышения сосудистой проницаемости и нарушения процессов неоангиогенеза [13,14, с.7].

Полиморфный локус Glu298Asp гена eNOS

Полиморфизм гена эндотелиальной NO-синтазы приводит к уменьшению содержания оксида азота, являющегося основным вазодилататором, что сопровождается усилением вазоконстрикции. В литературе описаны ассоциации этого полиморфизма с развитием ишемической болезни сердца, гипертонической болезни [15,16, с.7]. Нами не было выявлено ассоциаций полиморфизма гена eNOS с развитием патологии беременности. По данным Беспаловой С.Н. и соавт., полиморфизм этого гена приводит к развитию преэклампсии, однако его связь с развитием прочих осложнений не установлена [9, с.7].

Выводы

В результате проведенной работы выявлены ассоциации аллелей 20210A гена протромбина, 634C гена VEGF, аллели 4G полиморфного локуса 5G/4G 675 гена PAI-1 с развитием осложнений беременности, обусловленных развитием тромбофилии и дисфункции эндотелия. Обнаружение генетических маркеров позволяет определить группу женщин с высокой вероятностью развития акушерской патологии и вовремя начать соответствующую терапию, включающую применение низкомолекулярных гепаринов, избегая патологического течения беременности [17, с.7].

Описанные выше полиморфизмы генов MTHFR, еNOS, FV не приводят к развитию гестационных осложнений.

1. Simcox L.E., Ormesher L, Tower C, Greer I.A. Thrombophilia and Pregnancy
Complications //Int J Mol Sci. 2015 Nov 30; 16 (12).
2. Близнецкая С.Л. Основные наследственные тромбофилии и их роль при привычном невынашивании беременности// Автореф. дисс. ... канд. мед. наук, 2009. С.4-5.
3. Агеева Л.И., Александрова Г.А., Зайченко Н.М. Здравоохранение в России. 2015 //Стат.сб./ Росстат. - М., 2015. С. 26. 4. Бондарь И.А., Филипенко М.Л., Шабельникова О.Ю. Ассоциация полиморфных маркеров rs7903146 гена TCF7L2 и rs1801282 гена PPARG (Pro12Ala) с сахарным диабетом 2 типа в Новосибирской области // Научно-практический медицинский журнал «Сахарный диабет», 2013.С.22-24.
5. Березина О.В., Вайнер А.С., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л. Ассоциация полиморфных вариантов генов фолатного цикла с риском развития агрессивных и индолетных лимфом // Сибирский научный медицинский журнал, выпуск № 2, том 31. 2011. С. 38-41.
6. Воронина Е.Н., Пикалов И.В., Хрипко Ю.Н., Филипенко М.Л. Исследование мутаций гена фактора гемокоагуляции V и гена протромбина в популяции г. Новосибирска. // Консилиум №4, 2004. С.39-41.
7. Poort S., Rosendaal F., Reitsma P. A coomon genetic variation in the 3’-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis // Blood 1996: 88, 3698-3703.
8. AparicioС, Dahlbäck B. Molecular mechanisms of activated protein C resistance. Properties of factor V isolated from an individual with homozygosity for the Arg506 to Gln mutation in the factor V gene// Biochem J. 1996 Jan 15; 313: 467–472.
9. Баранов В.С. Генетический паспорт — основа индивидуальной и предиктивной медицины // Под ред. В. С. Баранова. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2009. — 528 с.
10. Трифонова Е.А., Габидулина Т.В., Агаркова Т.А. Гомоцистеин, полиморфизмы гена MTHFR и осложнения беременности, 2011, 13-16.
11. Бицадзе В. О., Макацария А. Д. Тромбофилические состояния в акушерской практике. М., 2001. С.89-92.
12. Пизова Н.В. Тромбофилии: генетические полиморфизмы и сосудистые катастрофы, Москва, 2013; 88.
13. Arroyo J. A., Winn V. D. Vasculogenesis and angiogenesis in the IUGR placenta // Semin. Perinatol, 2008. V. 32.172 – 177.
14. Makris A., Thornton C., Thompson J. et al. Uteroplacental ischemia results in proteinuric hypertension and elevated sFLT-1 // Kidney Int. 2007. P 977 – 984.
15. Кузнецова Т.Ю, Гаврилов Д.В., Самоходская Л. М. Влияние полиморфизма Glu298Asp гена эндотелиальной NO синтазы на развитие поражений органов – мишеней при установлении артериальной гипертензии в молодом возрасте//Сибирский медицинский журнал,2010. С.33-36.
16. Куба А.А., Никонова Ю.М., Феликсова О.М. Ассоциация генетического полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота с сердечно – сосудистой патологией //Современные проблемы науки и образования, 2015. №3.
17. Бицадзе В. О., Макацария А. Д. Применение низкомолекулярных гепаринов в акушерской практике // Рус. мед. журн. 2000. Т. 8, № 18. С. 775–778.

Рецензии:

20.05.2017, 13:54 Розыходжаева Гульнора Ахмедовна
Рецензия: Статья посвящена актуальной проблеме. Оформлена по правилам оформления оригинальных научных работ. Материал статистически обработан. Выводы вытекают из проделанной авторами работы. Статья рекомендуется к печати.

21.05.2017, 17:17 Манин Константин Владимирович
Рецензия: Данная статья является актуальной по данному направлению. В статье прослеживается взаимосвязь течения беременности, заболеваемость матери и плода с генетическими особенностями пациенток. Однако одну фразу в начале надо изменить, так как складывается впечатление, что данная проблема (генетическая предрасположенность к болезням) характерна только для России. Статья выполнена в соответствии с требованиями. Я бы рекомендовал данную статью к печати.



Комментарии пользователей:

Оставить комментарий