Разделы: Медицина
Размещена 26.09.2017. Последняя правка: 26.09.2017.
Просмотров - 1563

ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА В ИЗУЧЕНИИ ПАТОГЕНЕЗА ПАНКРЕОНЕКРОЗА

Солодов Юрий Юрьевич

кандидат медицинских наук

Оренбургский Государственный Медицинский Университет

ассистент кафедры факультетской хирургии

Гусев Н.С., аспирант кафедры факультесткой хирургии; Демин Д.Б., д.м.н. профессор, заведующий кафедрой факультетской хирургии; Фуныгин М.С., к.м.н. ассистент кафедры факультетской хирургии. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

УДК 575.1/2; 616.37-002

В последнее время все больше клиницистов и ученых уделяют особое внимание проблеме острого панкреатита. Такое внимание определяется повсеместным ростом заболеваемости острым панкреатитом и увеличением удельного веса его деструктивных форм, сложностью диагностики, увеличением числа осложнений, отсутствием единой, стандартизованной стратегии и тактики лечения и, конечно, высокой летальность по данным различных авторов достигающей 20-25%, а при наиболее тяжелых и распространенных формах панкреонекроза - 50-80%[1,2,3,4,5,]. Увеличивается и число деструктивных форм заболевания, которые составляют 20-44% среди больных острым панкреатитом. При этом у 40-70% больных происходит инфицирование некротических очагов[6]. При этом, летальность в условиях инфицированного панкреонекроза составляет 80-90%[2,7,8]. Таким образом острый панкреатит занимает 2-е место среди острой хирургической патологии органов брюшной полости, опережая острый холецистит, но уступая острому аппендициту. Как видно из приведенных данных, проблема инфицированного панкреонекроза сохраняет актуальность за счет высокой летальности.

На сегодняшний день нет однозначных данных о микробном пейзаже инфицированного панкреонекроза. Это зависит от многих причин, во – первых, это технические погрешности в ходе проведения бактериологического исследования, во-вторых, технические погрешности в ходе забора материала. Так же, авторы считают, что бактериологическое исследование недостаточно объективно и не учитывает весь микробный пейзаж. Не все микроорганизмы возможно идентифицировать и высеять в условиях бактериологической лаборатории. Кроме того, нет данных о проведении вирусологических исследований биологического материала, взятого у больных с инфицированным панкреонекрозом, хотя известно, что вирусы способны вызывать острый панкреатит. В зарубежной литературе имеются данные о проведении серологического исследования сыворотки крови у пациентов с острым панкреатитом, у 51.2% и 90,9% был выявлен вирус Коксаки[9]. Кроме того, имеются данные о выявлении у пациентов с острым панкреатитом вируса Эпштейна-Барр[10]. Так же, в литературе имеются данные о роли микроорганизмов в развитии инфицированного панкреонекроза на 2-3 недели течения заболевания, когда возникает феномен транслокации. В литературе нет убедительных данных о роли микрофлоры в развитии панкреонекроза ранее 2 недели заболевания.

Цель исследования: провести микробный анализ выпота, полученного у больного с панкреонекрозом интраоперационно, в ходе лапароскопического дренирования сальниковой сумки.

Методика исследования: парапанкреатический выпот взят у пациента Б., 86 лет, который поступил в экстренном порядке в хирургическое отделение ГАУЗ ГКБ им. Н.И. Пирогова 06.12.15г. в 07.30 ч., через 5 часов от начала заболевания с жалобами на боли в животе, тошноту. Боли стали беспокоить после погрешности в диете. При поступлении выполнено УЗИ органов брюшной полости: хронический калькулезный холецистит. Диффузные изменения печени, поджелудочной железы (панкреатит). Диастаза мочи при поступлении – 209 ед/л, амилаза составила – 989 ед/л. Так же наблюдался небольшой лейкоцитоз. Пациенту назначена была массивная инфузионная, спазмолитическая терапия. С течением времени состояние пациента ухудшилось, боли стали интенсивнее, появились симптомы раздражения брюшины. По данным лабораторных методов исследования: амилаза – 1878 ед/л, диастаза мочи – 2772 ед/л. По данным УЗИ имеется свободная жидкость в брюшной полости. Выставлены показания к операции. 07.12.15г. пациенту проведена лапароскопическая санация и дренирование брюшной полости. Интраоперационно был взят пасев парапанкреатического выпота, а так же взят материал для проведения метагеномного анализа. У пациента был диагностирован острый геморрагический панкреонекроз. Бактериологическое исследование проводилось на базе бактериологической лаборатории ГАУЗ ГКБ им. Н.И. Пирогова с использованием специальных питательных сред. Метагеномный анализ проводился на базе Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УроРАН г. Оренбурга, при помощи ДНК-секвенатора MySeq («Illumina», США). Необходимо осветить принцип метагеномики. Суть метода заключается в следующем: анализ проводиться в 3 этапа. На первом этапе производиться фрагментирование анализируемой ДНК с помощью ультразвука или других методов  с последующим присоединением к полученным ДНК-фрагментам олигонуклеотидных адаптеров с известной последовательностью. Адаптеры необходимы для дальнейшей амплификации фрагментов ДНК. На втором этапе предполагается проведение амплификации каждого из этих фрагментов с помощью полимеразной цепной реакции(ПЦР), но не просто в смеси, а физически изолированно друг от друга. В нашем случае на платформе «Illumina» это достигается тем, что на поверхности чипа кластерно иммобилизуется праймер. Одиночная молекула ДНК-фрагмента с присоединенными адаптерами при денатурации попадает на один из кластеров и связывается с праймером. В результате ПЦР каждый из кластеров содержит иммобилизованные копии фрагмента. На третьем этапе происходит непосредственно секвенирование. ДНК-полимераза встраивает один из 4 dNTP, меченный флуорофором, в исследуемый фрагмент ДНК. Далее при помощи ССD камер происходит считывание флуоресценции. После этого, при помощи реагентов смываются флуоресцентные метки в результате чего цикл считывания повторяют[3, 6] . Полученную последовательность нуклеотидов идентифицируют в библиотеке генов.

Результаты исследования: бактериологическое исследование, проведенное на базе больницы им. Н.И. Пирогова, показало отсутствие роста микроорганизмов. Однако, по результатам метагеномного анализа были получены следующие результаты.

Основным выявленным таксономическим уровнем стало царство бактерии. в числе которых наиболее часто встречались следующие филумы: Proteobacteria, Firmicutes. Из них Proteobacteria является самой известной и многочисленной группой бактерий. В эту группу входят как патогенные для организма человека микроорганизмы, так и условно-патогенные. Группа Firmicutes – группа бактерий, представители которой являются условно-патогенной флорой человека, а так же широко используются в промышленности для процессов брожения. Из этих достаточно больших по численности филумов можно выделить несколько родов, которые наиболее часто встречались в результате исследования: Acinetobacter, Staphylococcus, Bacillus и Streptococcus. Из них Acinetobacter - род грамотрицательных бактерий из семейства Moraxellaceae, являются строгими аэробами. Бактерии данного рода широко повсеместно распространены и являются условно-патогенной флорой для организма человека, преимущественно заселяют кожный покров. Род Staphylococcus - неподвижные грамположительные кокки, являются факультативными анаэробами. Это достаточно распространенная группа микроорганизмов во внешней среде, являются представителями нормальной микрофлоры человека, заселяют преимущественно кожный покров, ротоглотку, носоглотку. Род Bacillus - род грамположительных палочковидных бактерий, образующих внутриклеточные споры, большинство бактерий этого рода являются аэробами или факультативными анаэробами. Широко распространены в природе, а именном в почве. Являются представителями нормальной микрофлоры организма человека. И, наконец, род Streptococcus -  шаровидные или овоидные аспорогенные грамположительные хемоорганотрофные факультативно-анаэробных бактерий из семейства Streptococcaceae. Достаточно широко распространены в организме человека, а именно, способны заселять ротоглотку, носоглотку, дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт, в частности толстый кишечник. Из всех представленных родов микроорганизмов можно выделить несколько видов - Acinetobacter baumannii, Acinetobacter gerneri, Staphylococcus fleurettii. Встречались наиболее часто и обладают всеми основными свойствами, характерными для своего вида, кроме того, они являются представителями условно-патогенной флоры человека.

Выводы:

1. Традиционный бактериологический метод исследования при изучении парапанкреатического выпота является малоинформативным.
2. Уже на первые сутки заболевания, в стадию стерильного панкреонекроза, в выпоте имеются различные микроорганизмы, которые, несомненно, несут определенную роль в патогенезе пенкреонекроза.
3. Различные микроорганизмы, выявленные в парапанкреатическом выпоте в дальнейшем могут быть источником полиинфекции.
4. Впервые проведено исследование парапанкреатического выпота с помощью метагеномного анализа.

1. Бежин А.И., Трошина С.А. // Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье". 2016. № 1. С. 12-20.
2. Литвин А.А., Лызиков А.Н. Профилактика инфекционных осложнений тяжелого острого панкреатита, 2011.
3. Марданов А. В., Бабыкин М. М., Белецкий А. В., Григорьев А. И., Зинченко В. В., Кадников В. В., Кирпичников М. П., Мазур А. М., Недолужко А. В., Новикова Н. Д., Прохорчук Е. Б., Равин Н. В., Скрябин К. Г., Шестаков С. В. Метагеномный анализ динамики изменений состава микробиома кишечника участников эксперимента «МАРС-500», имитирующего длительный космический полет. Москва, 2012.
4. Павликова Е.Ю. // Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии Минздрава России. 2010. Т. 1. № 10. С. 8.
5. Макаров В.В. // Ветеринария сегодня. 2014. С. 15-17.Набиева Ж.Г., Гараев Ю.А. // Московский хирургический журнал. 2011. № 5. С. 61-66.
6. Ребриков Д.В. и др. // NGS: высокопроизводительное секвенирование.2014. №10.С. 5-20.
7. Саганов В.П., Хитрихеев В.Е., Гунзынов Г.Д., Очиров В.С., Улан-Удэ, 2011.
8. Шелест П.В., Миронов В.И. // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2007. Т. 73. № 6. С. 5-9.
9. Aurelie R.Veronique R.Jean-Paul C. Epstein—Barr virus infection with acute pancreatitis. 2007.
10. Shanmugam JJ, Balakrishnan VV, George MM, Shenoy KT. Study of Coxsackie B viral infections in chronic pancreatitis patients from Kerala. 2012.

Рецензии:

27.09.2017, 11:09 Манин Константин Владимирович
Рецензия: Уважаемый Юрий Юрьевич! Ваша статья может быть рекомендована к публикации в журнале после устранения некоторых недочетов: 1. Отсутствует запятая на отрезке: ...стало царство бактерии. в числе которых.... 2.Возможно фраза, что бактериологической метод не информативен не совсем корректен. Для примера применение фотометрического анализа для установления числа колоний используемых вами филумов. 3. Желательно привести значения численности бактерий (n-m КОЕ/мл культуры). С уважением Манин К.В.

28.09.2017, 9:04 Розыходжаева Гульнора Ахмедовна
Рецензия: Статья требует доработки.Необходимо расширить раздел "Результаты исследования" с приведением конкретных результатов,в виде таблиц, с данными статистического анализа.Выводы должны вытекать из собственных результатов. Необходимо их конкретизировать (не различные микроорганизмы, а какие именно, и т.п).

Комментарии пользователей:

Оставить комментарий