Гормональный комплекс растений как один из основополагающих факторов успешного введения в культуру in vitro

Материалы и методы

Материалом для проведения исследований были следующие виды орхидных: Cephalantheradamasonium(Mill.) Druce), Himantoglossum caprinum (M. Bieb.) K. Koch, Ophrys oestrifera M. Bieb [4] (рис. 1).

                                                                        А                                             Б                                          В

Рис. 1.Cephalanthera damasonium (Mill.) Druce (А), Himantoglossum caprinum (M. Bieb.) K. Koch (Б), Ophrys oestrifera M. Bieb (В)

Экспедиционными исследованиями было охвачено центральный район главной горной гряды и западный район Южного берега Крыма. Для определения морфогенетического потенциала природного растительного материала в условиях invitro были использованы генеративные органы орхидей: семязачатки, завязи, пыльники. Сбор материала проводился с учетом законов биоэтики. В лабораторном эксперименте с культурой тканей экспланты культивировали на стерильних питательных середах: Мурасиге-Скуга (завязи), Нича и Нич (семязачатки и пыльники), Кнудсона С (стебель) [5]. В качестве эксплантов использовали вегетативне и генеративные органы орхидей, которые были отобраны в период вегетации (листя и стебли), в начале цветения (пыльники), и на 25-й день после опыления (завязи, семязачатки). Предварительно проводили поверхностную стерилизацию эксплантов стерилентами, подобранными для каждого типа экспланта, после чего их промывали стерильной дистилированной водой. Для пыльников использовали двойную стерилизацию 0,8 % Ag(NO₃)₂ и 70 % С₂Н₅ОН в течение 2 и 1 мин соответственно, для завязей – стерилизацию 80 % С₂Н₅ОН (1,5 мин) вместе с 15 % Н₂О₂ (2 мин), для стерилизации семязачатков – двойную стерилизацию 70 % С₂Н₅ОН (2 мин) вместе с 15 % Н2О2 (3 мин), для получения стерильной культуры из сегментов стебля - 0,1% HgCl2 с экспозицией 10 мин. К стерилизующему раствору добавляли эмульгатор Твин-20 (одну каплю на 100 мл раствора). Для удаления фенолов в воду для промывания эксплантов добавляли 7 % раствор L-цистеина, а процесс изоляции эксплантов проводили в стерильном растворе аскорбиновой кислоты на чашках Петри. Культивирование проводили в фотолюминостате ФСЛ-В (Россия) при 20–25⁰С, 16-часовом фотопериоде с освещением 1000–3000 лк и 70 % относительной влажности воздуха и в термостате ВТ-120 (Польша) при температуре 25⁰С и отсутствии освещения. Для индукции роста и поддержания культур тканей использовали индолилмасляную кислоту (ИМК), 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрациях от 0,5 мг/л до 3,0 мг/л (табл. 1).
 

Таблица 1. Варианты количественного соотношения экзогенных фитогормонов в питательных средах для культивирования генеративных органов орхидей invitro

В фиксированных образцах определяли количество индолилуксускной кислоты (ИУК), абсцизовой кислоты (АБК) и цитокининов (ЦТК) [9]. Фракцию гормонов выделяли 80%-ным этанолом, спирт упаривали. Водный остаток промораживали, центрифугировали при 10000 g, супернатант экстрагировали диэтиловым эфиром при рН 2,5 (ИУК и АБК) и бутанолом при рН 8 (ЦТК). Уровни связанных ИУК и АБК оценивали после химимческого гидролиза. Фракции ИУК и АБК очищали с помощью кислотно-щелочной переэкстракции и ТСХ на пластинах Silufol UV-254 (Kavalier, Чехия) в системе растворителей хлороформ:этилацетат:уксусная кислота (70:30:5). Очистку ЦТК проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке Дауэкс 50Wx8 (Н⁺ -форма, элюция аммиаком) и ТСХ в системе изопропанол:аммиак:вода (10:1:1). В качестве стандартов использовали препараты фитогормонов фирмы Sigma (США). Окончательный анализ качественного и количественного содержания фитогормонов проводился методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1200 LC c диодно-матричным детектором G 1315 В (США), колонка Eclipce XDB-С 18 2,1×150 мм, размер частиц 5 мм. Элюция проводилась в системе растворителей метанол:вода (37:63). Анализ и обработка хроматограмм проводилась с программным обеспечением Chem Station, версия В.03.01 в режиме online.

Все полученные результаты обрабатывали статистически с помощью компьютерной статистической программы Excel лицензионного пакета Microsoft Office 2007. В таблицах и на рисунках приведены средние арифметические и их статистические ошибки. Достоверность разницы оценивали по критерию Стьюдента, используя 5 % уровень значимости (Р≤0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Данные виды орхидей были выбраны в качестве объекта исследований не случайно. Повышенное внимание к орхидеям определяется не только их высокими декоративными качествами, но и уникальными особенностями биологии этих растений. Кроме этого, представители семейства почти повсеместно являются одним из уязвимых звеньев фитоценозов [1; 3; 10]. Без детального изучения орхидей и организации их эффективной научно обоснованной  сохранить наиболее редкие их виды во многих густонаселенных областях умеренной зоны невозможно.

Метод культуры клеток, тканей и органов растений решает проблему дифференциации и морфогенеза, поскольку клетки в условиях invitro лишены многих важных взаимодействий, которые контролируют эти процессы в целом организме. При этом создание разных условий культивирования invitro дает возможность изучать разные уровни организации высших растений и процессы дифференциации [2;3;5]. В наших исследованиях в качестве эксплантов были использованы листья, стебли, лепестки, завязи, семязачатки и пыльники орхидей. Для определения оптимальной стадии онтогенеза, на которой необходимо отбирать экспланты, учитывали данные,полученные при изучении содержания эндогенных фитогормонов. Учитывая соотношения ключевых фитогормонов, экспланты необходимо отбирать на стадии онтогнеза, для которой характерно максимальное содержание свободных форм ЦТК, ИУК и минимальное содержание свободной формы АБК [6;7;8]. Для листьев и стебля такой стадией, как видно на примере H. caprinum(табл. 2), является вегетация, поскольку вегетативные органы в этот период характеризуются наибольшим содержанием гормонов индольной

Таблица 2. Фитогормоны вегетативных органов Himantoglossumcaprinumв онтогенезе

Примечание: с – свободная форма, св – связанная форма фитогормонов

природы и цитокининов. Не смотря на то, что листья харатеризуются повышенным содержанием АБК, именно в этот период они содержали максимальные уровни цитокининов, которую играют важную роль в делении клеток и каллусогенезе.

По результатам проведенного скрининга ряда показателей для введения в культуру invitroбыли отобраны жизнеспособные экспланты оптимального размера, полученные из стебля и завязей, семязачатков и пыльников, которые сохраняли стерильность и пролиферировали. Жизнеспособные экспланты лепестков и листьев при данных условиях е пролиферировали, поэтому для введения в культуру invitroне использовались.

Главную роль в индукции деления клеток экспланта, образовании каллуса и морфогенезе играют фитогормоны, которые являются неотьемлемой частью

микроклонального размножения растений [11;12;13]. Перед подбором оптимальных концентраций и соотношений фитогормонов в питательной среде для культивирования эксплантов предварительно провели исследования содержания фитогормонов в интактных органах. Исследования по подбору оптимальных концентраций и соотношений фитогормонов в питательной среде показали на примере эксплантов из завязей, что максимальная частота каллусогенеза наблюдается на питательных средах, в которых сохраняется такое же соотношение цитокининов и ауксинов, как и для интактного органа. У O. oestrifera максимальная частота каллусогенеза наблюдается при культивировании на питательной среде с добавлениием экзогенных цитокининов и ауксинов в соотношении 1,7, что характерно для интактных органов (табл. 3). Для эксплантов завязей H caprinumтакое соотношение фитогормонов составило 1,5, а для C. damasonium– 1,5.

Таблица 3. Зависимость каллусогенеза эксплантов завязей орхидных от соотношения эндогенных и экзогенных цитокининов и ауксинов

При культивировании на питательных средах с другими количественными соотношениями фитогормонов частота каллусогенеза была значительно меньше и не превышала для всех типов эксплантов 10 % (рис. 2)

Рис. 2. Интенсивность каллусогенеза из эксплантов завязей (А) и стебля (Б) орхидных на питательных средах с разным соотношением экзогенных цитокининов и ауксинов: 

Результаты работы расширяют представление о роли фитогормонального комплекса вегетативных и генеративных органов растений в процессах роста и развития и могут служить основой для разработки эффективных методов размножения редких орхидных в культуре invitro при помощи экзогенных регуляторов роста. Кроме того, полученные данные указывают на перспективность применения методов микроклонального размножения редких и исчезающих видов растений, в частности орхидей, и могут быть использованы для сохранения генофонда орхидных.

Выводы

1. Впервые установлена взаимосвязь интенсивности каллусогенеза из эксплантов вегетативных и генеративных органов орхидных и соотношения составляющих фитогормонального комплекса на определенных этапах онтогенеза, что необходимо учитывать при разработке методов микроклонального размножения этих видов.
2. Показано, что максимальная частота каллусогенеза в определенных условиях культивирования характерна для генеративных органов орхидей, которые отличаются повышенным содержанием цитокининов, индолилуксусной кислоты и низким уровнем абсцизовой кислоты.
3. Установлено, что максимальная частота каллусогенеза для эксплантов из генеративных и вегетативных органов орхидных наблюдается на питательных средах с подобным соотношением экзогенных и эндогенных фитогормонов.