Статья опубликована в №17 (январь) 2015
Разделы: Биология
Размещена 08.11.2014. Последняя правка: 15.01.2015.
Просмотров - 4865

БИОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ ДЛЯ УСКОРЕННОЙ ВНУТРИРОДОВОЙ ДЕТЕКЦИИ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA

Садртдинова Гузелия Рафиковна

Ульяновская ГСХА им.П.А.Столыпина

аспирант

Васильев Д.А., доктор биологических наук., профессор ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им.П.А.Столыпина»

УДК 579

Научные исследования проведены  при финансовой поддержке «Фонда содействия  развитию малых форм предприятий  в научно-технической сфере»

Klebsiella — род условно-патогенных бактерий, относящихся к семейству Enterobacteriaceae. C учетом последней классификации, на сегодняшний день род состоит из 5 видов [Holt J.G., 1994]: Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella terrigena, Klebsiella rhinoscleromatis.

Область распространения и жизнедеятельности представители рода достаточна широка. Так, бактерии данного рода  встречаются в фекалиях человека, на коже и слизистых дыхательных путей, в почве, воде, фруктах и овощах [Podschun R, Ullmann U., 1998].  Наиболее частыми возбудителями клебсиеллезов, и поэтому, отчасти, наиболее изученными являются Klebsiella pneumoniae и Klebsiella oxytoca. Бактерии этого рода вызывают пневмонию, урогенитальные инфекции, конъюнктивиты, менингиты, сепсис, острые кишечные инфекции [Золотухин С.Н., 2004]. 

Идентификация энтеробактерий любого рода - это достаточно трудоемкий процесс и, как правило, включает три этапа: 1) первичную идентификацию; 2) установление рода (дифференциацию родов) и 3) идентификацию вида и внутриродовую дифференциацию [Brisse, S., J. Verhoef, 2001].
Существует множество  схем исходящие из первоначальной дифференциации культур на образующие и не образующие сероводород и индол, расщепляющие и не расщепляющие лактозу, что позволяло с учетом этих свойств определить более рациональный выбор тестов в ходе дальнейшего исследования. Известны примеры использования ЭВМ для составления соответствующего набора. Так, для идентификации энтеробактерии были разработаны алгоритм и программа на основе широко распространенной схемы Edwards — Ewing . При помощи ЭВМ автор показала, что набор из 11 биохимических тестов (образование индола, реакции с метиловым красным и Фогеса—Проскауэра, наличие уреазы, лизиндекарбоксилазы, фенилаланиндезаминазы, газообразование в глюкозе, ферментация инозита, сорбита, арабинозы и рамиозы) дает воможность надежно идентифицировать свежевыделенные штаммы в 86,8% случаев.

Бактерии вида Klebsiella oxytoca до не давнего времени включались в состав вида Klebsiella pneumoniae, однако позже все индолположительные штаммы Klebsiella  pneumoniae были выделены в отдельный вид –Klebsiella oxytoca. 

Цель исследования- провести подбор и апробацию набора биохимических тестов, позволяющих наиболее точно провести внутриродовую идентификацию бактерий рода Klebsiella.

Материалы и методы исследования.

В наших исследованиях были использованы 25 штаммов бактерий, предварительно типированных  как бактерии рода Klebsiella, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии им.П.А.Столыпина, из них 5 штаммов относящихся к роду Klebsiella, но не дифференцированные по виду . Первичная идентификация (высев на среды Эндо, Плоскирева, Левина) и окраска по Граму  подтвердила принадлежность данных штаммов к бактериям семейства Enterobacteriacea. Проверка на «подвижность» дала возможность предварительно отнести все 5 штаммов к бактериям рода Klebsiella- на полужидком агаре наблюдался неподвижный рост бактерий.

Основными дифференцирующими признаками внутри семейства Enterobacteriacea (род Klebsiella, род  Escherichia, род Enterobacter, род Serratia) являются: подвижность, индолообразование, реакция с метиловым красным, реакция Фогеса- Проскауэра, газ из D-глюкозы, ферментация углеводов (сорбитол) [Balows, A., and B. Duerden, 1998]. На основании анализа имеющейся на сегодняшний день литературы, нами были выбраны биохимические тесты, которые наилучшим образом позволяют идентифицировать и  провести внутриродовую дифференциацию бактерий рода  Klebsiella. К этим тестам относятся: образование индола, тест на уреазу, реакция с метиловым красным (MR-тест), реакция Фогеса- Проскауэра (VP-тест), ферментация углеводов (сахароза, глюкоза, сорбит). Исследования проводились при помощи следующих сред и реактивов: реактив Ковача (определение индолообразования), набор для ускоренного микрообъемного определения уреазы бактерий,  среда Кларка (для постановки реакций MR/VP), среда Гисса (для выявления сахаролитической активности бактерий). Для определения биохимических и ферментативных  свойств использовали  односуточные культуры Klebsiella[Fanner JJ 3rd, Davis BR, Hickman-Brenner FW, McWhorter A, Huntley-Carter GP, Asbury MA, Riddle C, Wathen-Grady HG, Elias C, Fanning GR, et al. 1985].

Результаты исследования и обсуждение.

В таблице 1 представлены результаты исследования штаммов бактерий рода Klebsiella, полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии им.П.А.Столыпина по основным дифференцирующим признакам

Таблица 1- Дифференцирующие признаки бактерий  рода Klebsiella, на основании которых  была произведена идентификация изучаемых штаммов

Изучаемые штаммы	Тест							Типируемый вид
	индол	уреаза	углеводы			MR	V P
			сах.	глюк.	сорб.
Klebsiella (?)1	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)2	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)5006	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)5007	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)532	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)5202	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)45	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)49	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)76	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)244	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)9	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)53	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)85	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)81	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)1a	-	-	-	-	+	+	-	ozeanae
Klebsiella (?)1b	+	+	+	+	+	-	+	oxytoca
Klebsiella (?).2a	+	+	+	+	+	-	+	oxytoca
Klebsiella (?)3	+	+	+	+	+	-	+	oxytoca
Klebsiella (?)4	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)8	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)11	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)19	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)23	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiella (?)10	+	+	+	+	+	-	+	oxytoca
Klebsiella (?)24	+	+	+	+	+	-	+	oxytoca
Klebsiella (?)25	+	+	+	+	+	-	+	oxytoca
Klebsiella (?)26	+	+	+	+	+	-	+	oxytoca
Klebsiella (?)2013	+	+	+	+	+	-	+	oxytoca
Klebsiella (?)576	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae
Klebsiela (?)50	-	+	+	+	+	-	+	pneumoniae

На основе использования указаных в таблице 1  тестов, видовая принадлежноть 20 штаммов бактерий рода Klebsiella из музея кафедры  была подтверждена  , а у 5 штаммов, первоначально нетипируемых по виду, видовая принадлежность была определенна. 

Выводы.

Результаты проведенных исследований позволяют утверждать, что данный набор биохимических тестов, наилучшим образом помогает во внутриродовой дифференциации бактерий Klebsiella. Вместо использования значительного  числа тестов (например, весь «цветной ряд» Гисса), которые в основном не столь показательны и длительны для анализа (по результатам наших исследований), достаточно использовать 7 тестов. Предлагаемый набор тестов позволяет не только идентифицировать  Klebsiellaна фоне других  энтеробактерий, но и провести быструю внутриродовую дифференциацию. У 5 штаммов, которые изначально были отнесены к бактериям рода Klebsiella,в ходе исследования, были определены виды- все 5 штаммов относятся к бактериям рода Klebsiella вида pneumoniae.

1. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных // Ульяновск. – 2004. – С. 64 – 75.
2. Balows, A., and B. Duerden.Topley & Wilson's microbiology and microbial infections, 9th ed., vol. 2. Oxford University Press, Oxford, United Kingdom- 1998.
3. Brisse, S., and J. Verhoef. Phylogenetic diversity of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.- 2001.-924.
4. Fanner JJ 3rd, Davis BR, Hickman-Brenner FW, McWhorter A, Huntley-Carter GP, Asbury MA, Riddle C, Wathen-Grady HG, Elias C, Fanning GR, et al. Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin, Microbiol. 1985 Jan; 21(1):46-76.
5. Holt J.G., editor in ch. Bergey's manual of determinative bacteriology. Baltimor: Williams & Wilkins; 1994.
6. Podschun R, Ullmann U. Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods, and pathogenicity factors. Clin Microbiol Rev. 1998.

Рецензии:

13.11.2014, 16:07 Киселева Наталья Станиславовна
Рецензия: В статье дается оценка набору биохимических тестов, позволяющих быстро провести дифференциацию бактерий рода Klebsiella внутри рода. Вместо использования значительного числа тестов, которые более длительны для анализа и менее информативныавтором применено всего 7 тестов.,которые позволяют не только идентифицировать Klebsiellaна фоне других энтеробактерий, но и провести их быструю внутриродовую дифференциацию. Результаты исследований даны очень кратко, по сравнению с остальным объемом статьи, в реферативной форме. Нет интерпритации таблицы. Считаю, что при достаточном расширении объема "Результатов" статья будет соответствовать требованиям, предьявляемым к научным публикациям и может быть рекомендована к печати.

13.11.2014, 16:09 Киселева Наталья Станиславовна
Рецензия: В статье дается оценка набору биохимических тестов, позволяющих быстро провести дифференциацию бактерий рода Klebsiella внутри рода. Вместо использования значительного числа тестов, которые более длительны для анализа и менее информативныавтором применено всего 7 тестов.,которые позволяют не только идентифицировать Klebsiellaна фоне других энтеробактерий, но и провести их быструю внутриродовую дифференциацию. Результаты исследований даны очень кратко, по сравнению с остальным объемом статьи, в реферативной форме. Нет интерпритации таблицы. Считаю, что при достаточном расширении объема "Результатов" статья будет соответствовать требованиям, предьявляемым к научным публикациям и может быть рекомендована к печати.

4.12.2014, 13:15 Иванова Елена Иннокентьевна
Рецензия: Использование сокращенного набора биохимических тестов в практике рутинной работы бактериологических лабораторий имеет место для применения и не является новым. Статья автора не имеет исследовательского характера, но вполне может быть познавательна для студентов медицинских, биологических учебных заведений. В материалах и методах считаю необходимым сделать ссылку на методические указания или Отраслевой стандарт, которые могут быть использованы при идентификации бактерий данного рода, тем более автор не предлагает ничего нового. Действительно, в данной статье требуется расширение результатов, необходима обосновательная база выбора именно этих 7 тестов (которые предлагает автор) для идентификации Klebsiella spp. Выборка штаммов (18) также мала. Статья после доработки и расширения может быть опубликована как образовательная.



Комментарии пользователей:

Оставить комментарий