Статья опубликована в №36 (август) 2016
Разделы: Сельское хозяйство
Размещена 30.08.2016. Последняя правка: 29.08.2016.
Просмотров - 2759

МОРФОГЕНЕЗ И РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ СТЕВИИ (STEVIA REBAUDIANA BERTONI) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Цвигун Галина Васильевна

нет

Институт бионергетических культур и сахарной свеклы

научный сотрудник

РОИК Н.В., академик НААН Украины

УДК 633.66

Введение. В пищевой и фармацевтической промышленности многих стран мира широко используют синтетические заменители сахара с высоким коэффициентом сладости: аспартам, ацесульфам, цикламат и сахарин. Они экономически выгоднее, но не совсем полезны для здоровья.

Перспективным натуральным сахарозаменителем неуглеводной природы, обладающим лечебно-профилактическими свойствами, есть стевия медовая. Одним из способов расширения генетического разнообразия этой культуры, источником полезных вариаций является сомаклональная изменчивость в условиях культуры in vitro.

Культура тканей способствует повышению морфогенетической активности, формируя растения-регенеранты с желаемыми признаками под воздействием состава питательной стреды. Растения, полученные на искусственных питательных средах в условиях in vitro, как правило могут в той или иной степени отличаться от исходных форм новыми положительными свойствами и являться исходным материалом для традиционной селекции [1].

Процесс морфогенеза зависит от многих факторов, но наличие регуляторов роста (их тип, концентрация и соотношение) есть главным индуктором, с помощью которого можно регулировать механизм реализации морфогенетического потенциала, направлять0 развитие экспланта на дифференциацию тканей и органогенез[2].

Эксплантом для индукции морфогенеза может быть любая часть растения: сегменты стебля и апексы, отрезки корней, части листьев и черешков, сегменты соцветий, лепестков, генеративные органы и прочее. Такие экспланты образуют зачатки органов или воспроизводят растения через каллюс [3, 4].

Для стевии недостаточно изучены особенности морфогенеза в культуре изолированных тканей. Украинский ученый Ильенко И.И. методом индуцированного морфогенеза создал ряд новых сомаклональных вариантов, отличающихся некоторыми морфологическими признаками и биохимическим составом гликозидов [5]. Зарубежные исследователи получали растения-регенеранты, которые морфологически не отличались от растений-доноров [6]. Поэтому целью нашего исследования было провести оценку морфогенетического потенциала различных генотипов стевии в зависимости от типа эксплантов и состава питательной среды для получения сомаклонов.

Материалы и методика исследований Культивирование тканей и органов проводили традиционными методами культуры тканей [7]. Материалом для исследований служил каллюс листовых, черешковых и стеблевых эксплантов 2-го пассажа, который образовался на питательной среде с высокоактивным ауксином 2,4-Д и цитокинином 6-БАП. Культивирование проводили на модифицированных питательных средах Мурасиге и Скуга, дополненных фитогормонами ауксинами и цитокининами [8]. Масса эксплантов составляла 50 – 70 мг. Экспланты культивировали на питательной среде для индукции морфогенеза в течение 4-5 недель. Частоту морфогенеза определяли в процентах учитывая количество эксплантов с морфогенными структурами в соотношении к общему количеству анализируемых. Полученные микропобеги отделяли от каллюса и пересаживали на новую модифицированную питательную среду Гамборга [9] с оптимальной концентрацией НУК 0,5 мг/л для ризогенеза. Растения-регенеранты пересаживали в перлитно-песчаную смесь для адаптации при повышенной влажности. Опыты проводили в трехкратной повторности. Полученные экспериментальные данные исследований обрабатывали статистически с использованием компьютерной программы Мicrosoft Excel 2003 [10]. Основным заданием экспериментальных исследований, модифицируя состав питательной среды, изменить направление морфогенетического процесса, выделить генотипы с високим морофогенетическим потенциалом и получить сомаклональные линии для селекции.

Результаты исследований. Каллюсную ткань листового, черешкового и стеблевого происхождения пересаживали на регенерационную питательную среду, где определяли ее морфогенетическую активность. Каллюс культивировали на питательной среде с различным гормональным составом. При этом интенсивность морфогенеза была неодинаковой. Особенности образования побегов у эксплантов разных типов изображено на рисунке 1.

Наши исследования каллюсной ткани различного происхождения показали, что морфогенный каллюс из листьев способен формировать максимальное количество микропобегов на питательной среде с фитогормонами НУК и кинетин, с концентрацей 0,03 мг/л и 1 мг/л соответственно. Однако каллюс черешковых и стеблевых эксплантов характеризовался низким морфогенетическим потенциалом и образовывал существенно меньшее количество побегов. Для изучения интенсивности морфогенеза зависимо от генотипа в дальнейших исследованиях использовали каллюс из листьев. Исследованиями установлено, что воспроизводство растений через каллюс наблюдается путем геморизогенеза или гемогенеза с последующей индукцией корневой системы.

Как известно, каллюсные клетки после дифференциации могут развиваться по-разному. Модифицируя состав питательной среды, возможно, изменить направление морфогенетических процессов (табл. 1).

Результаты индукции морфогенетического потенциала различных эксплантов свидетельствуют о том, что каллюсные культуры стевии имели высокую морфогенетическую активность, которая легко управлялась регуляторами роста. При этом высокое (1:10) соотношение фитогормонов 3,0 мг/л НУК и 0,3 мг/л кинетина способствует росту неморфогенного каллюса независимо от генотипа.

 

Рис.1. Влияние регуляторов роста на формирование микропобегов стевии на эксплантах различного происхождения в условиях in vitro 

Образование корней (ризогенез) с каллюсной ткани наблюдается в основном только на питательной среде, содержащей 3,0 мг/л НУК и 0,03 мг/л кинетина (соотношение 100: 1). На этой питательной среде обнаружено два генотипа 2Х и 1М, каллюс которых образовал максимальное количество корней, соответственно 28,11% и 34,56%. Однако из каллюсной ткани, где наблюдали ризогенез, в дальнейшем не удалось получить побеги.

При этом, снижение соотношения гормонов до 0,03 мг/л НУК и 1,0 мг/л кинетина способствует образованию побеговых почек. Среди исследуемого материала выделились генотипы 2Х, 1М и ЗН. Из ростовых участков ткани сначала формировались побеговые почки, затем их отделяли от каллюса и пересаживали на среду Гамборга с повышенным содержанием ауксинов для корнеобразования. Такие условия обеспечили высокий коэффициент размножения у них, который находится в прямой зависимости от генотипа.

Кроме того, на морфогенной питательной среде, где уровень гормонов был несколько выше, а именно 1 мг/л НУК и 2 мг/л кинетина, начиная с 8 дня и в течение 60 суток, наблюдалось образование холмистых структур – зачатков соматических эмбриоидов.

Максимальный выход эмбриоидных структур было получено из генотипов 2Х и 1М, соответственно 12,98 и 17,91%. Эмбриоидные структуры, которые имели зачатки стеблей и корней, отделяли от каллюса и пересаживали на питательную среду для регенерации растений.

По результатам цитологических исследований видно, что эмбриогенные клетки возникают из мелких клеток на поверхности каллюса в виде меристематических бугорков, которые легко отделялись от каллюсной массы. В дальнейшем, частота их образования снижалась, а затем каллюсная культура теряла способность к эмбриогенезу. Эмбриоподобные структуры по сравнению с другими типами органогенеза ускоряют процесс получения растений-регенерантов. Такие растения (сомаклоны) отличались от исходных форм по морфологическим признакам в условиях in vitro. По результатам соматического эмбриогенеза получено существенно низкое количество растений-регенерантов, которые не имели селекционной ценности.

Как свидетельствуют результаты статистической обработки, регуляторы роста имели решающее значение в корнеобразовании (рис. 2). Их доля влияния была достаточно высокой и составляла 90,3%.

Проведен сравнительный анализ влияния факторов (генотипа и регуляторов роста) на процесс ризогенеза каллюсной ткани стевии. При этом, не выявлено существенного влияния генотипа, доля влияния которого всего– 2,3%. Взаимодействие этих факторов была малозначительным 5,1%.

 

Рис 2. Доля влияния факторов на ризогенез каллюса стевии

Диаграмма изображает влияние генотипа и регуляторов роста на регенерацию эмбриоидов (рис.3).

Анализируя морфогенный потенциал каллюсной ткани, по факторам воздействия видно, что важное значение для стимуляции соматических эмбриоидов имели регуляторы роста. Однако фитогормоны нужны лишь для закладки эмбриоидов, следовательно для начала этого процесса.

Далее образованные эмбриоидные бугорки отделяли от каллюса и переносили на питательную среду без регуляторов роста, они одновременно образовывали хорошо развитую корневую систему с почкой, из которой вскоре вырастали семядоли. Побеги формировались через 14 – 18 суток. Интенсивность регенерации эмбриоидов была низкой, часто образовывались только корни или побеги. Полученные побеги клонировали, пересаживая на питательную среду для микроразмножения, много из них погибало, только 69,3% образовали полноценные растения. Сформированные молодые растения сначала адаптировали , а затем высаживали в открытый грунт.

 

Рис. 3. Доля влияния факторов на соматический эмбриогенез

На соматический эмбриогенез в условиях in vitro максимальное влияние имеют также фитогормоны в составе питательной среды. Доля влияния ауксинов и цитокининов составляла 85,6%. От генотипа этот процесс зависел на 3,1%, а взаимодействие вышеназванных факторов была в 3 раза выше. Фактор генотипа составил 9,3% от совокупности всех других факторов.

Результаты воздействия исследуемых факторов на побегообразовательную способность представлено на рис. 4.

Из рис.4 следует, что способность каллюса образовывать побеги на 91% зависит от гормонального уровня питательной среды и лишь на 1,8% от самого генотипа. Взаимодействие этих факторов была 6,1%, другие факторы – 1,1%.

В результате исследований морфогенетических особенностей каллюсных культур получили сомаклоны стевии (рис. 5), которые отличались по фенотипу от исходных форм.

 

Рис. 4. Степень влияния факторов на побегообразовательную способность каллюсной массы стевии

 

Рис. 5. Формирование растений-регенерантов стевии с каллюсной ткани листового происхождения в зависимости от генотипа и типа морфогенеза

Как видно из результатов исследований, максимальное количество сомаклонов получено через органогенез (геммогенез). При этом наибольшее количество каликлонов получено из таких селекционных номеров как 2Х, 1М и ЗН, соответственно 31,45%; 36,48% и 31,14%. Все остальные номера имели несколько меньшие показатели. Такая морфогенетическая активность может быть лишь частично обусловлена генотипом, так как в условиях искусственной питательной среды преобладающее воздействие оказывает гормональный состав.

Соматический эмбриогенез ускоряет и упрощает процесс образования растений-регенерантов, поскольку сразу формируются полноценные соматические зародыши. Новую генетическую изменчивость в данном случаи вызывает нестабильность генома и особый характер деления клеток каллюсной ткани. Кроме того, сформированы побеги в результате органогенеза нужно еще пересаживать на питательную среду для ризогенеза. Однако в нашем исследовании органогенез имеет преимущества над эмбриоидогенезом, в результате которого получено максимальное количество сомаклонов стевии независимо от генотипа.

На основании морфологического анализа из растений-регенерантов били, отобраны линии, которые отличались от исходных генотипов по высоте растений, количеству продуктивных побегов, длине междоузлий, массе листьев и устойчивости к полеганию. В табл. 2 представлена фенотипическая вариабельность сомаклонов, образовавшихся в результате индукции морфогенного калюса листового происхождения.

Результаты свидетельствуют о том, что сомаклоны отстают в росте по высоте растений, сравнительно с исходными формами, кроме одной линии 166 S-1, высота которой составляла 72,05 см в сравнение с контролем 67,75 см. Все сомаклоны по количеству продуктивных побегов превосходили контрольные формы. Средняя длина междоузлий сомаклональных линий значительно меньше исходных генотипов. Такая изменчивость обеспечивала формирование низкорослых, компактных кустов с многочисленными листьями. Новые морфологические признаки способствовали существенному увеличению массы сырых листьев. Низкорослые формы были устойчивы к полеганию, что положительно влияет на механическую обработку и качество листьев стевии.

Выводы. Проведенные исследования  в условиях in vitro показали, что морфогенетическая активность и регенерация растений зависят от типа эксплантов, генотипа и соотношения фитогормонов в питательной среде. Листовые экспланты образуют максимальное количество микропобегов, а в дальнейшем наибольший выход сомаклональных вариантов.

Соотношение регуляторов роста больше всего влияет на морфогенетические процессы в калюсной ткани. Преобладание цитокинина над ауксином (0,03 мг/л НУК и 1,0 мг/л кинетина) способствует образованию побеговых почек, при этом особенно отличились генотипы 2Х, 1М и ЗН. Повышение уровня фитогормонов 1 мг/л НУК и 2 мг/л кинетина приводит к формированию соматических эмбриоидов. Наибольшее количество соматических эмбриоидов, соответственно 12,98 и 17,91% образовали генотипы 2Х и 1М.

Максимальное количество сомаклонов получено через органогенез (гемогенез). При этом наибольшее количество каликлонов получено из таких селекционных номеров как 2Х, 1М и ЗН, соответственно 31,45%; 36,48% и 31,14%

Все сомаклоны по главным производственным показателем (масса сырых листьев) превышали исходные формы. Выделена линия 128 S-7, с максимальной массой листьев 84,95 г с одного растения и предлагается для производственного испытания.

1. Larkin, P.J. Somaclonal variation – a novel source of variability from cell cultures for plant im-provement/ P.J. Larkin, W.R. Scowcroft // Theor. Appl. Genet. – 1981. – Vol. 60. – P. 197-214.
2. Білоус С.Ю. Особливості калюсогенезу Populus tremula L. в культурі in vitro /С.Ю. Білоус // Науковий вісник НЛТУ України : зб. наук.-техн. праць. – Львів : РВВ НЛТУ України. – 2012. – Вип. 22.10. – С. 19-25.
3. Thorpe T.A. Callus organization and de novo formation of shoots, roots and embryos in vitro // In: Technigues and Applications of Plant Cel and Tissue Culture to Agriculture and Industry. – Ontario: Univ. of Guelph, 1982. – P 115-138.
4. Vasil I.K. Regeneration in cereal and other grass species / I.K. Vasil, V.I. Vasil // In Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. V.3. – New York: Acad. Press, 1986. – P. 121-150.
5. 10. Ильенко И.И., Продуктивность сомаклональных вариантов стевии и качественный состав дитерпеновых гликозидов в ее листьях. / Ильенко И.И., Яворская Т.К., Бех Н.С., Скульская // Введение в культуру стевии - источника низкокалорийного заменителя сахара. К., 1990.-с.156.
6. Аparajita M. In Vitro Regeneration of Stevia rebaudiana (Bert) from the Nodal Explant Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology / M. Аparajita, P. Amita – 2007. Vol. 16. Issue 1. P. 59-62.
7. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. /Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. К. : Наук. мнение, 1980. – 488 с.
8. Murashige Т. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures / Т. Murashige, F. A. Skoog // Physiol. Plant. – 1962. – vol. 5., № 95 – P. 473-497.
9. Gamborg O.I., Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley / O.I. Gamborg, D.E. Eveleing // Can. J. Biochem. – 1968. – Vol. 46, N 5. – P. 417-421.
10. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. – М. : Агропромиздат, 1985. – 351 с.

Рецензии:

16.09.2016, 11:24 Кучер Лариса Ивановна
Рецензия: Уважаемый автор, представленная Вами статья является актуальной. В статье показаны принципиальные возможности использования биотехнологических методов, способствующие созданию исходных, генетически выровненных, клональных линий стевии медовой с улучшенными производственными показателями вегетативной массы, для расширения генетического разнообразия, интродукции культуры в почвенно-климатических условиях Восточной Европы. Новые формы стевии, натурального сахарозаменителя не углеводной природы, получены на основании сомаклональной изменчивости в условиях культуры in vitro. Доказано, что калюсная ткань образовывалась на питательной среде с ауксином 2,4Д и цитокинином 6-БАП, установленных концентраций. В статье представлена методика получения сомаклональных вариантов. Безусловно, позитивным моментом данной работы является комплексный подход изучения морфогенеза растений стевии. Авторы статьи для производственного испытания предлагают новую линию стевии 12-5-7 с массой листьев 84-95г. Представленные в статье результаты содержат научную новизну, практическую ценность и могут быть опубликованы в открытой печати.

Комментарии пользователей:

Оставить комментарий