Публикация научных статей.
Вход на сайт
E-mail:
Пароль:
Запомнить
Регистрация/
Забыли пароль?
Вакпрофи. Публикация статей ВАК, Scopus
Научные направления
Поделиться:
Разделы: Биология, Медицина
Размещена 03.10.2018. Последняя правка: 07.10.2018.

ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОГО ПОТЕНЦИАЛА МЕЛАТОНИНА В КРОВИ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

Максимович Дарья Игоревна

магистр

Белорусский Государственный Университет, биологический факультет

ассистент кафедры биохимии

Корик Е. О., кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии биологического факультета БГУ


Аннотация:
Изучена возможность использования мелатонина для коррекции патобиохимических проявлений экспериментального метаболического синдрома на примере активности таких антиоксидантных ферментов, как супероксиддисмутаза, каталаза и церулоплазмин, в гемолизате эритроцитов и сыворотке крови крыс.


Abstract:
The possibility of using melatonin for correcting the pathobiochemical manifestations of the experimental metabolic syndrome was studied using as the example such antioxidant enzymes as superoxide dismutase, catalase and ceruloplasmin in the hemolysate of erythrocytes and serum of rats.


Ключевые слова:
супероксиддисмутаза; каталаза; церулоплазмин; метаболический синдром; окислительный стресс; мелатонин

Keywords:
superoxide dismutase; catalase; ceruloplasmin; metabolic syndrome; oxidative stress; melatonin


УДК 577.171.55

Введение

Распространенность метаболического синдрома, который включает в себя кластер сердечно-сосудистых факторов риска, связанных с ожирением и резистентностью к инсулину, последнее время резко возросла и приобрела характер эпидемии во многих развитых странах. Это расстройство характеризуется такими метаболическими нарушениями как гипертриглицеридемия, снижение уровня липопротеинов высокой плотности, повышение уровня липопротеинов низкой плотности, резистентность к инсулину, аномальная толерантность к глюкозе и гипертония, которые в сочетании с генетической предрасположенностью и абдоминальным ожирением являются факторами риска для развития сахарного диабета второго типа, сосудистого воспаления, атеросклероза и заболеваний почек, печени и сердца [1].

Одним из дефектов, связанных с развитием метаболического синдрома и сопровождающих его заболеваний, является избыток активных форм кислорода. Активные формы кислорода, генерируемые митохондриями и другими компонентами клетки, инициируют процессы перекисного окисления и вызывают повреждение различных клеточных компонентов [1].

В организме имеется комплексная система антиоксидантной защиты для борьбы с активными формами кислорода, которая состоит из антиоксидантных ферментов и некоторых неферментных ловушек свободных радикалов. Основными ферментами, катализирующими разложение активных форм кислорода, являются супероксиддисмутаза, каталаза и церулоплазмин.

С точки зрения антиоксидантной терапии метаболического синдрома огромный интерес представляет антиоксидант мелатонин (N-ацетил-5-метокситриптамин). Многочисленные данные подтверждают, что мелатонин является акцептором активных форм кислорода широкого спектра действия [2-4]. Он препятствует развитию реакций свободнорадикального окисления, при этом превосходя по эффективности такие классические антиоксиданты как витамин Е [5], глутатион и маннитол [6].

Принимая это во внимание, нами была изучена возможность использования мелатонина для коррекции окислительного стресса, который является одним их основных патобиохимических проявлений метаболического синдрома, на примере активности таких антиоксидантных ферментов как супероксиддисмутаза, каталаза и церулоплазмин в гемолизате эритроцитов и сыворотке крови крыс.

Таким образом, целью данного исследования является изучение влияния мелатонина на уровень окислительного стресса, который в свою очередь характеризуется изменением активности основных антиоксидантных ферментов, у крыс в рамках модели экспериментального метаболического синдрома. 

Материалы и методы

В эксперименте были использованы взрослые самцы крыс линии Wistar, весом 230-250 г. Животные содержались при температуре 20-24ºC. Соблюдался шумовой и световой режим. 37 крыс были разделены на четыре группы следующим образом:

1. контрольная группа – интактные животные (n=8),

2. опытная группа – животные с метаболическим синдромом (n=9),

3. опытная группа + мелатонин – животные с метаболическим синдромом, которым в течении трёх недель внутрибрюшинно вводили раствор мелатонина (n=10),

4. контрольная группа + мелатонин – интактные животные, которым впоследствии в течении трёх недель внутрибрюшинно вводили раствор мелатонина (n=10).

Крысы 1-ой и 4-ой группы (контроль) содержались на стандартной сбалансированной диете для грызунов (около 35% белка, 65% углеводов и 10% жира) и получали чистую воду в качестве питья, крысы 2-ой и 3-ей группы (метаболический синдром) содержались на богатой жирами диете (45% от общей суточной калорийности) и в качестве питья получали 25% раствор сахарозы.

Животные содержались на данных диетах в течение 10 недель, после чего крысам 3-ей и 4-ой групп внутрибрюшинно вводили раствор мелатонина (1 мг/кг) в течении последующих трёх недель. Свежий раствор мелатонина готовили каждый день, в качестве растворителя использовали 1% этанол в нормальном физиологическом растворе.

Через 13 недель после начала эксперимента проводили декапитацию животных, и дальнейшие операции проводили при температуре 0 – +4ºС.

Развитие метаболического синдрома определяли по приросту массы тела животного в течение эксперимента, по наличию подкожного и висцерального жира, и по наличию ярко выраженного жирового гепатоза после вскрытия животного.

В качестве субстрата для супероксиддисмутазы использовали раствор кверцетина. В качестве источника фермента использовались сыворотка и гемолизат эритроцитов, разведенные в 10 и 500 раз соответственно. Активность фермента определялась по степени ингибирования реакции автоокисления кверцетина. Измерения оптической плотности проводились на спектрофотометре Solar PV 1251C («Солар», Республика Беларусь) при длине волны 406 нм [7].

В качестве субстрата для каталазы использовали раствор перекиси водорода («Реахим», Россия). В качестве источника фермента использовались сыворотка и гемолизат эритроцитов, разведенные в 10 раз. Реакцию останавливали добавлением 4% молибдата аммония («Реахим», Россия). Интенсивность развивающейся окраски измеряли на спектрофотометре Solar PV 1251C («Солар», Республика Беларусь) при длине волны 410 нм [8]. 

Измерение активности церулоплазмина проводили в сыворотке крови крыс, по методике, основанной на окислении р-фенилендиамина («Реахим», Россия). Ферментативная реакция останавливалась добавлением фтористого натрия. По оптической плотности окрашенного раствора судили о концентрации церулоплазмина. Измерения оптической плотности проводились на спектрофотометре Solar PV 1251C («Солар», Республика Беларусь) при длине волны 530 нм [9].

Результаты исследования

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Динамика активности антиоксидантных ферментов.

№ серии

1

2

3

4

Удельная активность супероксиддисмутазы, нкат/мг гемоглобина/белка

Гемолизат

45,783±6,2

256,083±24,833**а

158,65±26,583**b

28,75±7,916*b

Сыворотка

0,0527±0,0071

0,1132±0,014**а

0,0805±0,0158*b

0,0512±0,0092*b

Удельная активность каталазы, нкат/мг гемоглобина/белка

Гемолизат

157,751±15,25

182,762±15,667*а

84,757±9,909**b

75,870±9,474**b

Сыворотка

7,503±0,417

10,068±1,823*а

13,587±1,152*b

7,483±0,794*b

Удельная активность церулоплазмина, мкат/мг белка

Сыворотка

5,945±0,606

6,653±0,813*а

4,219±0,937*b

5,649±0,870*b

Примечание:

Серия 1 – интактные самцы;         

Серия 2 – самцы с экспериментальным метаболическим синдромом;

Серия 3 – самцы с экспериментальным метаболическим синдромом + мелатонин;   

Серия 4 – интактные самцы + мелатонин.

* – рассчитанное значение t-критерия Стьюдента меньше критического, следовательно, наблюдаемые различия значений опыта относительно контроля статистически незначимы (уровень значимости р>0,05).

** – рассчитанное значение t-критерия Стьюдента больше критического, следовательно, наблюдаемые различия значений опыта относительно контроля статистически значимы (уровень значимости р<0,05).

*a – различия ферментативной активности у интактных животных и животных с метаболическим синдромом.

*b – различия ферментативной активности у интактных и опытных животных в присутствии и отсутствии мелатонина.

Исследование активности супероксиддисмутазы в гемолизате эритроцитов и сыворотке крови крыс показало статистически значимые различия в значениях удельной активности фермента у интактных крыс и крыс с метаболическим синдромом. Удельная активность супероксиддисмутазы в гемолизате эритроцитов крыс с метаболическим синдромом оказалась почти в 6 раз выше, чем у интактных крыс, а в сыворотке крови крыс с метаболическим синдромом удельная активность супероксиддисмутазы оказалась вдвое больше, чем в сыворотке интактных животных. Это указывает на чрезмерную генерацию активных форм кислорода на фоне активации свободно-радикальных процессов у животных с метаболическим синдромом.

Были обнаружены статистически значимые различия удельной активности супероксиддисмутазы в гемолизате эритроцитов крыс с метаболических синдромом после внутрибрюшинного введения раствора мелатонина. Удельная активность супероксиддисмутазы в гемолизате эритроцитов крыс с метаболическим синдромом, находящихся на терапии мелатонином, оказалась на 38% ниже, чем у крыс с метаболическим синдромом в отсутствии влиятеля.

Исследование удельной активности каталазы в гемолизате эритроцитов показало статистически значимые различия в значениях удельной активности фермента после внутрибрюшинного введения раствора мелатонина как у интактных крыс, так и у крыс с метаболическим синдромом. Было обнаружено, что удельная активность каталазы в гемолизате эритроцитов крыс с метаболическим синдромом, находящихся на терапии мелатонином, более чем на 50% ниже, чем у крыс с метаболическим синдромом в отсутствии влиятеля.  Кроме того, оказалось, что удельная активность каталазы в гемолизате эритроцитов интактных крыс, находящихся на терапии мелатонином, также более чем на 50% ниже, чем у интактных крыс в отсутствии влиятеля.

Это означает, что экзогенный мелатонин, являясь мощным антиоксидантом, непосредственно участвует в процессах деградации свободных радикалов, и, снижая их количество, нивелирует избыточную активность основных ферментов антиоксидантной защиты организма в условия окислительного стресса, вызванного метаболическим синдромом.

В изучении влияния мелатонина на активность церулоплазмина в сыворотке крови интактных крыс и крыс с метаболическим синдромом статистически значимых различий выявлено не было, однако на примере имеющихся данных, отражённых в таблице 1, в динамике активности церулоплазмина прослеживается аналогичная тенденция как в случае с супероксиддисмутазой и каталазой. У крыс с метаболическим синдромом активность фермента на 12% выше, чем у интактных крыс. У животных с метаболическим синдромом, подвергшихся терапевтической коррекции мелатонином, значение удельной активности церулоплазмина на 36% ниже, чем у животных с метаболическим синдромом в отсутствии влиятеля.  Идентичная ситуация наблюдается и у интактных животных – у крыс, подвергшихся терапевтической коррекции мелатонином, значение удельной активности церулоплазмина на 5% ниже, чем у интактных крыс в отсутствии влиятеля.

Обcуждение pезультатов

Метаболический синдром, вызванный несбалансированным питанием и малоподвижным образом жизни, является мощнейшим индуктором разнообразных клеточных и биохимических аномалий, в том числе окислительных процессов. Потребление высоскокалорийной и сладкой пищи в рамках специальной диеты в результате интенсификации процессов гликолиза привело чрезмерному производству NADH и FADH2 [10]. Окисление NADH и FADH2 в митохондриальной цепи в условиях увеличения потока электронов сопровождается их утечкой из электронтранспортной цепи. В результате утечки электронов происходит четырёхступенчатое восстановление молекулы кислорода, которое объясняет разнообразие его активных форм в условиях гипергликемии [10-12].

Повышение уровня активных форм кислорода в организме неразрывно связано с активизацией ряда ферментов. В ходе исследования было обнаружено, что развитие метаболического синдрома сопровождается повышением активности супероксиддисмутазы, каталазы и церулоплазмина, которые в свою очередь являются основными ферментами антиоксидантной системы организма. Этот факт наглядно демонстрирует, что развитие метаболического синдрома неразрывно связано с интенсификацией процессов свободно-радикального окисления, и как следствие, повышением уровня активности антиоксидантных ферментов.

Также было установлено, что мелатонин обладает ярко выраженной антиоксидантной активностью, которая проявляется в снижении интенсивности свободно-радикальных процессов как у интактных животных, так и у животных с экспериментальным метаболическим синдромом. Способность мелатонина снижать уровень окислительного стресса в организме объясняется тем, что он напрямую взаимодействует с различными активными формами кислорода и восстанавливает их, тем самым нивелируя активность основных ферментов антиоксидантной системы организма, что объясняет снижение активности супероксиддисмутазы, каталазы и церулоплазмина в гемолизате и сыворотке крови крыс.

Заключение

Ежесуточное внутрибрюшинное введение раствора мелатонина в концентрации 1 мг/кг в течении трёх недель снижает уровень окислительного стресса, который в свою очередь является одним из основных патобиохимических проявлений метаболического синдрома. Существует множество документальных доказательств того, что что дефицит мелатонина достоверно ассоциируется со всеми сопровождающими метаболический синдром аномалиями метаболизма [13-21]. В связи с этим на сегодняшний день мелатонинзаместительная терапия у пациентов с ожирением – основным компонентом метаболического синдрома, а также с инсулинорезистентностью, дислипидемией и повышением артериального давления – рассматривается в качестве неотъемлемой части комплексной патогенетической терапии множества гормонально-метаболических нарушений, ставших новыми «мировыми пандемиями» XXI века. В связи с этим можно сделать вывод о том, что терапевтическая коррекция мелатонином заболеваний, которые сопровождаются избыточной генерацией активных форм кислорода, является перспективным направлением в биохимии и медицине и, вне всяких сомнений, требует дальнейшего изучения.

Библиографический список:

1. Bonomini F. Metabolic syndrome, aging and involvement of oxidative stress // Aging Dis. - 2015. - №6. - С. 109–120.
2. Escames G. Age-dependent lipopolysaccharide-induced iNOS expression and multiorgan failure in rats: Effects of melatonin treatment // Exp. Gerontol. - 2006. - №41. - С. 1165–1173.
3. Sonmez M. F. Effect of melatonin and vitamin C on expression of endothelial NOS in heart of chronic alcoholic rats // Toxicol. Ind. Health. - 2009. - №25. - С. 385–393.
4. Buldak R. J. Effects of ghrelin, leptin and melatonin on the levels of reactive oxygen species, antioxidant enzyme activity and viability of the HCT 116 human colorectal carcinoma cell line // Mol. Med. Rep. - 2015. - №12. - С. 2275–2282.
5. Khaldy H. Comparative effects of melatonin, L-deprenyl, Trolox and ascorbate in the suppression of hydroxyl radical formation during dopamine autoxidation in vitro // J. Pineal Res. - 2000. - №29. - С. 100–107.
6. Poeggeler B. Melatonin: A potent, endogenous hydroxyl radical scavenge // J. Pineal Res. - 1993. - №14. - С. 57–60.
7. Костюк В. А., Потапович, А. И., Ковалева Ж. В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопросы медицинской химии. - 1990. - №36(2). - С. 88–91.
8. Королюк М. А. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. - 1988. - №1. - С. 16–19.
9. Камышников В.С., Колб В. Г. Клиническая биохимия. - Минск: Беларусь, 1976. - 311 с.
10. Pennathur S. Mechanisms of oxidative stress in diabetes: Implications for the pathogenesis of vascular disease and antioxidant therapy // Front Biosci. - 2004. - №9. - С. 565–574.
11. Терентьев А. А., Казимирский А. Н., Ефремов А. Д. Биологическое окисление. Методическое пособие для самостоятельной работы студентов лечебного, педиатрического, стоматологического и фармацевтического факультетов. - Москва: РНИМУ им. Н.И. Пирогова, 2011. - 73 с.
12. Albert Lehninger L. Lehninger Principles of Biochemistry. - W. H. Freeman, 2005. - 1119 с.
13. Bielli A. Antioxidants and vascular health // Life Sci. - 2015. - №143. - C. 209–216.
14. Barton S. K. Ventilation-induced brain injury in preterm neonates: A review of potential therapies // Neonatology. - 2016. - №110. - С. 155–162.
15. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function // Physiol. Rev. - 2002. - №82. - С. 47–95.
16. Singh A. K. Age dependent nitro-oxidative load and melatonin receptor expression in the spleen and immunity of goat Capra hircus // Exp. Gerontol. - 2014. - №60. - С. 72–78.
17. Aktoz T. The protective effects of melatonin and vitamin E against renal ischemia-reperfusion injury in rats // Ren. Fail. - 2007. - №29. - С. 535–542.
18. Lissoni P. Five years survival in metastatic non-small cell lung cancer patients treated with chemotherapy alone or chemotherapy and melatonin: A randomized trial // J. Pineal Res. - 2003. - №35. - С. 12–15.
19. Pandi-Perumal S. R. Melatonin antioxidative defense: Therapeutical implications for aging and neurodegenerative processes // Neurotox. Res. - 2013. - №23. - С. 267–300.
20. Okatani Y. Acutely administered melatonin restores hepatic mitochondrial physiology in old mice // Int. J. Biochem. Cell Biol.. - 2003. - №35. - С. 367–375.
21. Urata Y. Melatonin induces gamma-glutamylcysteine synthetase mediated by activator protein-1 in human vascular endothelial cells // Free Radic. Biol. Med. - 1999. - №27. - С. 838–847.




Рецензии:

4.10.2018, 9:19 Манин Константин Владимирович
Рецензия: Статья рекомендуется к публикации в журнале. С наилучшими пожеланиями к.б.н. Манин Константин Владимирович

04.10.2018 11:11 Ответ на рецензию автора Максимович Дарья Игоревна:
Уважаемый Константин Владимирович, выражаю Вам благодарность за положительную рецензию!

5.10.2018, 15:37 Умарова Замира Фахриевна
Рецензия: Статья написана на актуальную тему, построена логически верно, рекомендую к публикации
07.10.2018 11:11 Ответ на рецензию автора Максимович Дарья Игоревна:
Благодарю за положительную рецензию!

7.10.2018, 11:28 Ахмадиев Габдулахат Маликович
Рецензия: 7.10.2018. Ахмадиев Габдулахат Маликович. Методология и методика оформления и написания научной статьи ни совсем правильно. Цель работы написать бы в такой форме: Исходя из выше указанных проблем нами были определены цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является исследования влияния мелатонина на уровень окислительного стресса. Достоверность динамики активности антиоксидантных ферментов между контрольной и опытными группами не приводятся. После обсуждения pезультатов исследований обычно приводят заключение или выводы. В целом работа заслуживает положительной оценки. После исправления указанных замечаний работа может быть опубликована. Доктор ветеринарных,профессор биологии и методики преподавания биологии,член- корресподент РАЕ, профессор кафедры химии и экологии Наберженочелнинского института Казанского (Приволжского) федерального университета.
07.10.2018 11:11 Ответ на рецензию автора Максимович Дарья Игоревна:
Цель исследования полностью отражает суть работы в целом и она абсолютно точно совпадает с Вашей формулировкой, посему я не вижу смысла менять одно на другое. Для демонстрации достоверности различий между контрольной и опытной группой, а также внутригрупповых различий, был использован t-критерий Стьюдента. Я учла Ваше замечание касательно раздела "Заключение" и добавила его в статью. Благодарю за ценные замечания и положительную рецензию.



Комментарии пользователей:

Оставить комментарий


 
 

Вверх