Статья опубликована в №25 (сентябрь) 2015
Разделы: Медицина
Размещена 21.09.2015. Последняя правка: 18.09.2015.
Просмотров - 2473

БЕТА-ЛАКТАМАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ: ПРОИСХОЖДЕНИЕ ФЕНОМЕНА

Жильцов Иван Викторович

доктор медицинских наук

Учреждение образование "Витебский государственный медицинский университет""

профессор кафедры инфекционных болезней

Торосян Т.А., ассистент кафедры ЧЛХ и стоматологии детского возраста; В.М.Семенов, С.К. Егоров, кафедра инфекционных болезней; Прудников А.Р., кафедра патологической физиологии, УО «Витебский государственный медицинский университет»

УДК 616.31-002: 616-035.1:616-035.2

Введение

Как известно, в ротовой полости обитает большое количество (более 200 видов) разнообразных микроорганизмов – патогенных, условно-патогенных и непатогенных [6]. Многие из них способны вызывать гнойно-воспалительные поражения челюстно-лицевой области [8,20]. Ротовая микрофлора первой принимает на себя удар любых антибактериальных препаратов, поступающих в организм человека через рот (включая антибиотики, содержащиеся в пище). Ввиду этого, многие представители ротовой микрофлоры обладают устойчивостью к антибиотикам, нередко – сразу к нескольким [9,18].

Основной группой антибактериальных препаратов, наиболее часто используемых в клинической практике, являются бета-лактамы, которые в сумме составляют до 80% от всех применяемых антибиотиков [5]. Соответственно, устойчивость микроорганизмов ротовой полости к антибиотикам бета-лактам­ного ряда имеет наибольшее клиническое значение. Предполагается что данная устойчивость в первую очередь опосредуется бактериальными бета-лактамаза­ми [5, 8,20]. На данный момент описаны 4 основных класса бета-лактамаз – А, В, С и D, причем наиболее распространены бета-лактамазы класса А (TEM и SHV). В клинической практике давно и успешно используются комбинации антибиотиков бета-лактамного ряда с известными ингибиторами бета-лактамаз класса А: ампициллин-сульбактам, амоксициллин-клавуланат, тикарциллин-клавуланат и пиперациллин-тазобактам [4,11].

Тем не менее, ферментативная деградация бета-лактамов вследствие продукции бета-лактамаз различными представителями микрофлоры ротовой полости – важный, но далеко не единственный механизм устойчивости бактерий к данным антибактериальным препаратам. Существует ряд существенных для клиники механизмов резистентности микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам: видоизмененные ПСБ со сниженной аффинностью к бета-лактамным антибиотикам, ускоренная эвакуация антибиотиков из бактериальной клетки с помощью мембранных молекулярных насосов («помп»), снижение проницаемости наружных мембран бактерий для бета-лактамных антибиотиков [9, 10]. Описан также феномен продукции бета-лактамаз непатогенными бактериями ротовой полости, которые таким образом защищают патогенную микрофлору от воздействия бета-лактамов (т.н. «ко-патогенная» флора); при этом патогенные микроорганизмы могут сами не продуцировать бета-лактамазы [21].

Помимо этого, макроорганизм сам по себе небезразличен к введению антибиотиков. Данные соединения являются чужеродными для него, поэтому он стремится освободиться от них, используя различные пути и механизмы (система цитохромов P 450, почечные дегидропептидазы и т.д. [13,16]).

Следует также принять во внимание недавно описанный феномен т.н. «эндогенной» устойчивости к бета-лактамным антибиотикам за счет наличия бета-лактамазной активности у некоторых эндогенных факторов человеческого организма, прежде всего – у сывороточного альбумина [1,2]. Известно, что альбумин – один из основных белков ротовой жидкости, причем его концентрация может существенно расти при воспалительном процессе либо при кровоточивости слизистой полости рта [12]. Вклад альбумина в общий уровень бета-лактамазной активности ротовой жидкости никогда не изучался.

Уточнение природы бета-лактамазной активности ротовой жидкости позволило бы целенаправленно бороться с обусловленной ею неэффективностью бета-лактамных антибиотиков в лечении как терапевтических, так и хирургических гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области. 

Материалы и методы

Объектом для исследования послужили образцы ротовой жидкости пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области, собранные в 2012-13 гг. на базе отделения челюстно-лицевой хирургии УЗ «Витебская областная клиническая больница №1».

Для выявления природы бета-лактамазной активности ротовой жидкости были выполнены следующие эксперименты:

1. Фракционирование образцов ротовой жидкости (n=4) при помощи препаративного диск-электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле. По завершении электрофореза столбики геля разрезались на равные фрагменты длиной 0,5 см, после чего изолированно определялась бета-лактамазная активность каждого из них; расположение белковых фракций выявлялось путем окраски контрольных столбиков геля красителем Кумасси R250.

2. Обработка образцов ротовой жидкости с наиболее выраженной бета-лактамазной активностью (n=10) взвесью гранул голубой сефарозы (реактив, 1 мг которого избирательно связывает до 11,0 мг человеческого сывороточного альбумина, практически не взаимодействуя с другими белками; CAS 66456-82-4) [17]. Данный эксперимент позволяет оценить долю бета-лактамазной активности ротовой жидкости, опосредованную сывороточным альбумином.

К 100 мкл проб ротовой жидкости добавлялось по 100 мкл взвеси гранул голубой сефарозы, смесь встряхивалась 30 минут, затем гранулы отделялись центрифугированием в течение 60 с при 14,5 тыс. об/мин.

3. Ингибирование бета-лактамазной активности образцов ротовой жидкости (n=16) раствором тазобактама (ингибитора бактериальных бета-лактамаз класса А) в конечной концентрации 5 мг/мл.

Образцы слюны сохранялись при −20°С; непосредственно перед проведением исследования все пробы одновременно размораживались, после чего центрифугировались при 7.000 об/мин в течение 5 минут, затем отделялся прозрачный надосадок, который использовался в дальнейших исследованиях. В случае, если общий объем надосадка оказывался менее 0,2 мл, он доводился до 0,2 мл стерильным физиологическим раствором хлорида натрия.

Определение уровня бета-лактамазной активности ротовой жидкости выполнялось путем спектрофотометрической регистрации распада антибиотика цефалоспоринового ряда нитроцефина, для чего использовалась тест-система «БиоЛактам» (ООО «СИВитал», РБ).

В основе тест-системы «БиоЛактам» лежит спектрофотометрическая методика, базирующаяся на изменении окраски синтетического антибиотика цефалоспоринового ряда нитроцефина при распаде его бета-лактамной связи. При этом происходит батохромный сдвиг в хромофорной системе молекулы, и максимум ее поглощения меняется с 390 нм на 486 нм. Нитроцефин разрушается всеми известными бета-лактамазами [14]. Бета-лактамазная активность оценивалась в % распада стандартного количества нитроцефина, вносимого в каждую анализируемую пробу. Эксперименты выполнялись в соответствии со стандартной методикой, изложенной в инструкции, прилагаемой к тест-системе. 

Результаты и обсуждение

1. Исследование вклада человеческого сывороточного альбумина в суммарную бета-лактамазную активность ротовой жидкости

Обработка образцов ротовой жидкости взвесью гранул голубой сефарозы показала, что в 4 пробах из 10 включённых в данный эксперимент бета-лак­тамазная активность практически не изменилась после обработки, а в оставшихся 6 пробах – снизилась в среднем на 19,9±4,4% (см. рисунок 1). Средний уровень бета-лактамазной активности до обработки голубой сефарозой составил 72,7% (95% ДИ: 63,8…81,6; min 51,8 max 90,0), после обработки – 61,2% (95% ДИ: 46,7…75,7; min 30,7 max 88,1).

Как было указано ранее, голубая сефароза – коммерческий реагент, 1 мл гранул которого селективно связывает ≥11,5 мг человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), что позволяет оценить долю бета-лактамазной активности образцов ротовой жидкости, опосредованную исключительно альбумином.

Соответственно, результаты данного эксперимента показывают, что в 6 пробах ротовой жидкости бета-лактамазная активность совершенно не связана с присутствием ЧСА, в то время как в 4 оставшихся пробах ЧСА опосредует не более 20% суммарной бета-лактамазной активности ротовой жидкости. 

2. Результаты ингибирования бета-лактамазной активности ротовой жидкости раствором тазобактама

Ингибирование бета-лактамазной активности проб ротовой жидкости раствором тазобактама в итоговой концентрации 5 мг/мл показало, что указанная активность в ходе эксперимента снизилась в среднем на 83,2±21,6% (см. рисунок 2). Средний уровень бета-лактамазной активности проб до ингибирования составил 72,6% (95% ДИ: 66,7…78,5; min 55,5 max 91,2), после ингибирования – 11,2% (95% ДИ: 4,2…18,2; min 0 max 36,9).

Примечание: АКТ_исх – исходная активность, АКТ_сеф –

активность проб после обработки взвесью гранул голубой сефарозы

Рисунок 1 – Снижение бета-лактамазной активности ротовой жидкости

после обработки взвесью гранул голубой сефарозы

Рисунок 2 – Снижение бета-лактамазной активности ротовой жидкости

после ингибирования раствором тазобактама (5 мг/мл) 

При этом следует отметить, что в 10 из 16 исследованных проб (62,5%; 95% ДИ: 38,8…86,2) бета-лактамазная активность в результате ингибирования снизилась практически до нуля (уровень снижения составил 95-100% от исходного); это подтверждает, что бета-лактамазная активность в данных образцах ротовой жидкости связана исключительно с присутствием в них бактериальных бета-лактамаз класса А, поскольку тазобактам не взаимодействует с бета-лакта­мазами других классов, а бета-лактамазную активность ЧСА он ингибирует в значительно меньшей степени (в концентрации 5 мг/мл снижает собственную ферментативную активность альбумина на ≈20% от исходной [1]).

Все 6 проб ротовой жидкости, в которых часть бета-лактамазной активности (суммарно до 16,8%) была обусловлена эндогенными факторами, имели явные примеси крови и/или воспалительного экссудата. Соответственно, данная активность, скорее всего, связана с особыми свойствами человеческого сывороточного альбумина, что хорошо согласуется с результатами предыдущего эксперимента, согласно которому, ЧСА может обуславливать до 19,9% суммарной бета-лактамазной активности ротовой жидкости. 

3. Анализ бета-лактамазной активности изолированных белковых фракций ротовой жидкости

Фракционирование 4-х упомянутых ранее образцов ротовой жидкости с изолированным определением бета-лактамазной активности белковых фракций показало, что таковой активностью обладают многие белки, входящие в состав ротовой жидкости, и, в частности, сывороточный альбумин (молекулярная масса от 66,4 до 66,6 кДа [19]). Яркая полоса, соответствующая α-амилазе (58-62 кДа [17]), хорошо заметна на электрофореграммах ротовой жидкости (типичный пример приведён на рисунке 3).

Тем не менее, во всех четырёх случаях максимум указанной активности соответствовал белкам, молекулярная масса которых приблизительно соответствует 38,5-43,8 кДа. При этом в участках геля, соответствующих максимальному уровню бета-лактамазной активности, не было выявлено и документировано ни одной видимой глазом полосы окрашивания, что говорит об очень незначительной концентрации данных белков и, соответственно, об их очень высокой удельной бета-лактамазной активности, что нетипично для эндогенных белковых факторов макроорганизма наподобие ЧСА.

Известно, что молекулярная масса бета-лактамаз класса А, продуцируемых патогенными, условно-патогенными и непатогенными представителями микрофлоры полости рта (Morganellamorganii, Enterobactercloacae, Pseudomonasfluorescens, Psychrobacterimmobilis, Serratiamarcescens, Streptomycescacaoi, Morganellamorganii, Acinetobacterbaylyi, Pectobacteriumcarotovorum и др.), может находиться в интервале 38-44 кДа [3] (см. таблицу 1).

Рисунок 3 – Бета-лактамазная активность белковых фракций

ротовой жидкости, изолированных электрофорезом

Примечания: 1) На графике по оси абсцисс отложены номера фрагментов геля в порядке возрастания (от старта к финишу электрофореза), по оси ординат – уровень бета-лакта­мазной активности в соответствующих фрагментах; 2) На денситограмме сверху показаны пики, соответствующие визуализированным полосам белковых фракций в трубке геля; 3) На денситограмму наложены фотография оригинальной электрофореграммы и график распределения бета-лактамазной активности по длине трубки геля; 4) На фотографии электрофореграммы указана молекулярная масса полосы α-амилазы и участка, соответствующего максимальному выявленному в эксперименте уровню бета-лактамазной активности. 

Таким образом, можно констатировать, что бета-лактамазная активность изученных образцов ротовой жидкости связана преимущественно с белками, отличающимися низкой концентрацией (на соответствующих участках электрофореграмм не видны окрашенные полосы), но высокой удельной бета-лакта­мазной активностью, и при этом имеющих молекулярную массу около 40 кДа, что существенно меньше, чем у человеческого сывороточного альбумина. 

Таблица 1 – Молекулярная масса бета-лактамаз, продуцируемых некоторыми представителями микрофлоры полости рта (из базы данных BRENDA [3]) 

Выводы

1. Бета-лактамазная активность ротовой жидкости преимущественно (на 80-100%) обусловлена белками с молекулярной массой 38-43 кДа, обладающими чрезвычайно высокой бета-лактамазной активностью на единицу массы, причём указанная активность эффективно (в среднем на 83% от исходной, max 100%, min 45%) подавляется ингибиторами бета-лактамаз класса А (в частности, тазобактамом). Помимо этого, данные белки не сорбируются гранулами голубой сефарозы, сохраняя свою активность в ротовой жидкости.

Указанные белки с наибольшей вероятностью являются бета-лактамазами класса А, продуцируемыми представителями патогенной, условно-патогенной и непатогенной микрофлоры полости рта;

2. В существенно меньшей степени (на 0-20%) бета-лактамазная активность ротовой жидкости обусловлена эндогенными факторами человеческого организма, прежде всего – человеческим сывороточным альбумином;

3. Наиболее очевидным способом преодоления высокой бета-лактамазной активности ротовой жидкости является использование для лечения профильных пациентов ингибитор-защищенных антибиотиков бета-лактамного ряда.

1. Природа бета-лактамазной активности сыворотки крови: структура активного центра альбумина / И.В. Жильцов [и др.] // Медицинская панорама: рецензируемый научно-практический журнал для врачей и деловых кругов медицины. – Минск. – 2011. – №7 (124). – с. 49-54.
2. Природа бета-лактамазной активности сыворотки человеческой крови / И.В. Жильцов, И.С. Веремей, В.М. Семенов и др. // Медицинская панорама: рецензируемый научно-практический журнал для врачей и деловых кругов медицины. – Минск. – 2011. – №7 (124). – с. 31-35.
3. BRENDA – The Comprehensive Enzyme Information System. Information on EC 3.5.2.6 – beta-lactamases / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http:// www.brenda-enzymes.info/enzyme.php?ecno=3.5.2.6#MOLECULAR WEIGHT. – Дата доступа: 22.01.2015.
4. Drawz, S.M. Three decades of beta-lactamase inhibitors / S.M. Drawz, R.A. Bonomo // Clin Microbiol Rev. – 2010. – Vol. 23, №1. – P. 160-201.
5. Elander, R. Industrial production of beta-lactam antibiotics / R. Elander // Applied microbiology and biotechnology. – 2003. – Vol. 61 (5–6). – P. 385-392.
6. Elisabeth, M. Bacterial diversity in the oral cavity of ten healthy individuals / M. Elisabeth, D. Clara, C. Gary et al. // ISME J. – 2010. – Vol. 4 (8). – P. 962-974.
7. Francesco D.G. Cibacron Blue and proteomics: the mystery of the platoon missing in action / Francesco D.G., Pier G.R., D'Amato A., Chung M. // J. Proteomics. – 2011. – Vol. 74 (12). – P. 2856-2865.
8. Guobis, Ž. Microflora of the oral cavity in patients with xerostomia / Ž. Guobis, V. Kareivienė, N. Basevičienė et al. // Medicina (Kaunas). – 2011. – Vol. 47 (12). – P. 646-651.
9. Karbach, J. Multiple resistance to betalactam antibiotics, azithromycin or moxifloxacin in implant associated bacteria / J. Karbach, A.S. Callaway, B. Willershausen et al. // Clin. Lab. – 2013. – Vol. 59 (3-4). – P. 381-387.
10. Livermore, D.M. Mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics / D.M. Livermore // Scand. J. Infect. Dis. Suppl. – 1991. – Vol. 78. – P. 7-16.
11. Mealey, K.L. Penicillins and beta-lactamase inhibitor combinations / K.L. Mealey // J. Am. Vet. Med. Assoc. – 2001. – Vol. 218, №12. – P. 1893-1896.
12. Meurman, J.H. Salivary albumin and other constituents and their relation to oral and general health in the elderly / J.H. Meurman, P. Rantonen, H. Pajukoski, R. Sulkava // Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. – 2002. – Vol. 94 (4). – P. 432-438.
13. Moellering, R.C. The carbapenems: new broad spectrum beta-lactam antibiotics / R.C. Moellering, G.M. Eliopoulos, D.E. Sentochnik // J. Antimicrob. Chemother. – 1989. – Vol. 24, Suppl. A. – P. 1-7.
14. Novel method for detection of b-lactamases by using a chromogenic cephalosporin substrate / H.C. Callaghan [et al.] // Antimicrobial agents and chemotherapy. – 1972. – Vol. 1, №4. – P. 283-288.
15. Occurrence and mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics in clinically important species of Enterobacter / D. Michálková-Papajová [et al.] // Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. – 2001. – Vol. 50, №3. – P. 121-130.
16. Pea, F. Pharmacokinetic aspects of treating infections in the intensive care unit: focus on drug interactions / F. Pea, M. Furlanut // Clin. Pharmacokinet. – 2001. – Vol. 40, №11. – P. 833-868.
17. Peng, Y. Purification and high-resolution top-down mass spectrometric characterization of human salivary α-amylase / Y. Peng, X. Chen, T. Sato et al. // Anal. Chem. – 2012. – Vol. 84 (№7). – P. 3339-3346.
18. Putnam, F.W. The Plasma Proteins, 2nd Ed., Vol. 1 / Ed. F.W. Putnam // Academic Press, New York (1975). – pp. 133-181.
19. Prieto-Prieto, J. Microbiological basis of oral infections and sensitivity to antibiotics / J. Prieto-Prieto, A. Calvo // Med Oral Patol Oral Cir Bucal. – 2004. – Vol. 9, Suppl. 15-8. – P. 11-14.
20. Tets, V.V. Unknown pathogens from the human oral microflora of interest for otorhinolaryngology / V.V. Tets, G.V. Tets, D.S. Vikina et al. // Vestn. Otorinolaringol. – 2014. – Vol. 1. – P. 33-36.
21. Van Steenbergen, T.J.M. Pathogenic synergy: mixed infections in the oral cavity / T.J.M. van Steenbergen, A.J. van Winkelhoff, J. de Graaff // Antonie van Leeuwenhoek. – 1984. – Vol. 50, Issue 5-6. – P. 789-798.

Рецензии:

21.09.2015, 9:14 Розыходжаева Гульнора Ахмедовна
Рецензия: Статья представляет большой научно-практический интерес, посвящена актуальной проблеме. Статья имеет правильную структуру. Выводы сосуществуют поставленной цели и задачам. Написана грамотна, убедительно. Рекомендую статью к публикации

21.09.2015, 9:18 Розыходжаева Гульнора Ахмедовна
Рецензия:  Статья соответствует всем требованиям, предъявляемым к оригинальным статьям. Написана грамотна и убедительно.Рекомендую статью к публикации.

22.09.2015, 19:58 Походенько-Чудакова Ирина Олеговна
Рецензия: Р Е Ц Е Н З И Я на статью И.В. Жильцова, Т. А. Торосян, В.М. Семенова, С.К. Егорова, А.Р. Прудникова «БЕТА-ЛАКТАМАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ: ПРОИСХОЖДЕНИЕ ФЕНОМЕНА» Представленная статья «БЕТА-ЛАКТАМАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ: ПРОИСХОЖДЕНИЕ ФЕНОМЕНА» посвящена весьма актуальному вопросу – анализу бета-лактамазной активности ротовой жидкости (РЖ). Актуальность избранной авторами темы публикации определяет тот факт, что уточнение природы бета-лактамазной активности РЖ может способствовать разработке наиболее адекватных мероприятий направленных на борьбу с неэффективностью бела-лактамных антибиотиков, применяемых и при инфекционно-воспалительных процессах челюстно-лицевой области и шеи. Статья построена по принципу оригинальной статьи и состоит из: аннотации на русском и английском языках, ключевых слов, введения; раздела, содержащего материалы и методы исследования, результатов и их обсуждений, выводов, библиографического списка источников специальной литературы в количестве 21 наименования (2 – на русском и 19 – на английском языке). Материал, представленный в публикации, изложен авторами последовательно, грамотно, легко читается и воспринимается. Выводы логично вытекают из полученных авторами результатов и являются в полной мере обоснованными. Статья хорошо иллюстрирована (содержит 3 рисунка и 1 таблицу). При этом хотелось бы посоветовать авторам, более четко определить цель исследования. Однако сделанное замечание не носит принципиального характера и не снижает общей положительной оценки публикации и ее высокой научно-практической значимости. Заключение. На основании изложенного выше, считаю возможным заключить, что статья И.В. Жильцова, Т. А. Торосян, В.М. Семенова, С.К. Егорова, А.Р. Прудникова «БЕТА-ЛАКТАМАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ: ПРОИСХОЖДЕНИЕ ФЕНОМЕНА» соответствует профилю электронного журнала «SCIARTICLE.RU» и межет быть рекомендована к опубликованию. Заведующая кафедрой хирургической стоматологии учреждения образования «Белорусский государственный» медицинский университет», доктор медицинских наук, профессор И. О. Походенько-Чудакова 22 сентября 2015 года



Комментарии пользователей:

Оставить комментарий