Статья опубликована в №109 (сентябрь) 2022
Разделы: Медицина
Размещена 06.09.2022. Последняя правка: 06.09.2022.
Просмотров - 560

Пути оптимизации терапии коронавирусной инфекции, вызванной COVID-19.

Абилов Пулат Мэлисович

ассистент, PhD (доктор философии по медицинским наукам)

Ташкентская Медицинская Академия

преподаватель

Ирискулов Бахтиёр Уктамович, доктор медицинских наук, профессор, зав кафедрой Нормальной и патологической физиологии Ташкентской Медицинской Академии; Бобоева Зухра Нуриллаевна – кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры Нормальной и патологической физиологии Ташкентской Медицинской Академии

УДК 616.2-022-085

Актуальность. Иммунные паттерны COVID-19 включают лимфопению, активацию и дисфункцию лимфоцитов, аномалии гранулоцитов и моноцитов, повышенную продукцию цитокинов и повышенное количество антител. Лимфопения является ключевым признаком пациентов с COVID-19, особенно в тяжелых случаях. CD69, CD38 и CD44 в высокой степени экспрессируются на CD4+ и CD8+ Т-клетках пациентов, а вирусспецифические Т-клетки в тяжелых случаях демонстрируют фенотип центральной памяти с высокими уровнями IFN-γ, TNF-α и IL-2. Тем не менее, лимфоциты демонстрируют фенотип истощения с активацией белка запрограммированной гибели клеток-1 (PD1), Т-клеточного домена иммуноглобулина и домена-3 муцина (TIM3) и члена 1 подсемейства С лектин-подобных рецепторов клеток-киллеров (NKG2A) [3]. Уровень нейтрофилов значительно выше у тяжелых больных, тогда как процент эозинофилов, базофилов и моноцитов снижен. Повышенная продукция цитокинов, особенно ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10, является еще одной ключевой характеристикой тяжелого течения COVID-19. Уровни IgG также повышены, и имеется более высокий титр общих антител [8].

С момента открытия нового коронавируса SARS-CoV-2 ученые спорят о его происхождении [6]. Было высказано предположение, что SARS-CoV-2 является продуктом лабораторных манипуляций. Однако генетические данные не подтверждают эту гипотезу и показывают, что SARS-CoV-2 не произошел от ранее известного вирусного остова [9].

Анализ геномов и сравнение с ранее известными геномами коронавирусов показывают, что SARS-CoV-2 обладает уникальными особенностями, которые отличают его от других коронавирусов: оптимальная аффинность к рецептору ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) и полиосновный сайт расщепления в месте соединения шипов S1/S2, который определяет инфекционность и круг хозяев [7,10].

SARS-CoV-2 очень похож на SARS-подобные коронавирусы летучих мышей [2], и летучие мыши могут быть резервуарным хозяином. RaGT13 примерно на 96% идентичен SARS-CoV-2 с некоторыми различиями в домене связывания шиповидного рецептора (RBD), что может объяснить различия в сродстве ACE2 между SARS-CoV-2 и SARS-подобными коронавирусами.

Сайт многоосновного расщепления SARS-CoV-2 отсутствует в бета-коронавирусе панголина, который имеет сходство с SARS-CoV-2. Кроме того, последовательность RBD шиповидного белка (S) свидетельствует о том, что он возник в результате естественного эволюционного процесса [1].

Оценки самого последнего общего предка SARS-CoV-2 датируют эпидемию периодом между концом ноября 2019 г. и началом декабря 2019 г., что совместимо с первыми зарегистрированными случаями. Таким образом, после зоонозного события и до приобретения сайта расщепления многоосновного фурина произошла незамеченная передача человеку.

Также все большее внимание уделяется другому натуральному продукту, известному грибу G. Lucidum. Состав данного натурального продукта очень широк, включая супероксиддисмутазу, которая также снижает патогенетическое влияние «цитокинового шторма» не оказывая на печень побочных эффектов.

Также в последнее время все большее внимание уделяется еще одному натуральному продукту Алхадая, который представляет собой масло черного тмина. Я заметил, что и G. Lucidum и черный тмин в своем составе содержат карбоксильные группы, причем они не являются продолжением нитрогрупп и сульфгидрильных групп. Эти карбоксильные группы отходят от фенольных колец G. Lucidum и бензольных колец черного тмина  и была предложена идея создания нового препарата на основе G. Lucidum и Алхадая, и учитывая столь важное значение не только в лечении коронавирусной инфекции, но и в безопасном его применении, то данное исследование считается актуальной темой и требует его дальнейшего изучения

Научная новизна. Впервые привоится пример успешной терапии коронавирусной инфекции без проявления патологических процессов. Впервые в качестве лечения применены нетрадиционные методы лечения в лечении COVID-19.

Цель исследования. Оценить влияние новой векторной терапии (G. Lucidum, черный тмин) коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2.

Материалы и методы исследования. Для осуществления поставленной цели были проанализированы результаты лечения 50 больных с коронавирусной инфекцией, вызванной COVID-19. Все больные были разделены на группы: 1 группа – больные с коронавирусной инфекцией с подтвержденным положительным ПЦР тестом, леченных ивермектином в дозировке 300 мг массы тела (n=15), 2 группа – больные с коронавирусной инфекцией леченные байкалином в дозировке 500 мг (n=15), 3 группа – больные с коронавирусной инфекцией, леченные молнупиравиром 25 мг/кг массы тела (n=15), 4 группа – больные с коронавирусной инфекцией леченные новым препаратом на основе G. Lucidum и черного тмина (n=15).

Штаммы SARS-CoV-2 в мицелиальной фазе роста культивировали на агаре Сабуро (Difco, США) при 28 °С в течение 30 суток. Культурально-морфологические исследования культур штаммов осуществляли в соответствии с общепринятыми требованиями.

Выросшую в мицелиальной фазе культуру SARS-CoV-2 суспендировали в 0,15 М растворе NaCl, фильтровали через марлевый фильтр и обеззараживали добавлением раствора натрия мертиолата до конечной концентрации 0,1 мг/мл с последующим прогреванием в течение 40 мин при 56±1 °С и инкубацией при комнатной температуре в течение 24 ч. После обеззараживания взвеси грибов делали контрольные высевы на стерильность.

Для проведения RAPD-типирования коллекционных штаммов H. capsulatum использовали следующие праймеры: 1281 (5’-AACGCGCAAC-3’), 1283 (5’- GCGATCCCCA-3’), 1253 (5’-GTTTCCGCCC-3’) [Kersulyte D. et al., 1992]. Праймеры синтезированы ЗАО «Синтол» (Москва). Амплификацию ДНК с использованием «горячего старта» проводили в объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала: 10 - 20 нг геномной ДНК изучаемого штамма H. capsulatum, 15 пмоль каждого из олигонуклеотидных праймеров при проведении двухпраймерной реакции или 20 пмоль – в случае однопраймерной реакции, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата и 10 мкл ПЦР-буфера blue-2, содержащего Taq-полимеразу. Для предупреждения испарения на поверхность смеси наслаивали 30 мкл минерального масла. Амплификацию проводили на термоциклере «Терцик» (НПФ «ДНК-технология», Москва) в режиме: предварительный прогрев 94 °С – 5 мин, 45 циклов (94 °С – 30 с, 35 °С – 30 с, 72 °С – 60 с), финальная элонгация 72 °С – 5 мин.

Статистическую обработку проводили с учетом параметрических и непараметрических методов исследования.

Результаты исследования. Результаты тестирования панели до лечения продемонстрированы в таблице 1.

Таблица 1. Результаты тестирования панели ПЦР образцов.

Образец	SARS-CoV-2	COVID-19
1 группа (положительный)	+	+
2 группа (положительный_	-	+
3 группа (положительный)	+	+
4 группа (положительный)	+	+

 

После проведения электрофореза результаты 7 отдельных реакций ПЦР для каждого штамма SARS-CoV-2 были переведены в двоичную матрицу для последующего анализа in silico. Положительные результаты амплификации фиксировали как «1», а отрицательные как «0», что свидетельствовало о наличии или отсутствии определенного DFR-локуса у конкретного представителя SARS-CoV-2. Полученные DFR-профили коллекционных штаммов были дополнены профилями штаммов SARS-CoV-2, полученные в результате анализа in silico нуклеотидных последовательностей из базы данных Broad Institute of MIT and Harvard.

После лечения в 1 группе (лечение ивермектином) результаты ПЦР тестов продемонстрированы в таблице 2.

Таблица 2. Результаты лечения иверметином (1 группа) с помощью ПЦР-теста.

Величина пула	SARS-CoV-2	COVID-19
6 образцов плазмы	-	-
6 образцов плазмы	+	+
6 образцов плазмы	-	+
6 образцов плазмы	+	+

 

В таблице 3 представлены результаты лечения байкалином (2 группа) с помощью ПЦР-теста.

Таблица 3. Результаты лечения байкалином (2 группа) с помощью ПЦР-теста.

Величина пула	SARS-CoV-2	COVID-19
6 образцов плазмы	+	+
6 образцов плазмы	-	+
6 образцов плазмы	+	-
6 образцов плазмы	-	+

 

В таблице 4 представлены результаты лечения монупиравиром (3 группа) с помощью ПЦР-теста.

Таблица 4. Результаты лечения молнупиравиром (3 группа) с помощью ПЦР-теста.

Величина пула	SARS-CoV-2	COVID-19
6 образцов плазмы	+	-
6 образцов плазмы	-	-
6 образцов плазмы	+	+
6 образцов плазмы	-	-

 

В таблице 5 представлены результаты лечения нового комбинированного препарата на основе G. Lucidum и Алхадая.

Таблица 5. Результаты лечения нового комбинированного препарата на основе G. Lucidum и черного тмина.

Величина пула	SARS-CoV-2	COVID-19
6 образцов плазмы	-	-
6 образцов плазмы	-	-
6 образцов плазмы	-	-
6 образцов плазмы	+	-

 

Таким образом, лечение коронавирусной инфекции с помощью нового комбинированного препарата на основе G. Lucidum  и черного тмина является патогенетически обоснованным методом.

Праймеры с высоким содержанием G+C формируют более прочную связь с матрицей, а значит, увеличивается их способность связываться с частично некомплементарными участками ДНК. Это должно приводить к амплификации большего числа фрагментов и повышению дифференцирующей способности метода RAPD.

Таким образом, при проведении реакций амплификации с произвольными праймерами 1253, 1281 и 1283, различающимися по GC-составу, были получены стабильные, воспроизводимые, специфичные наборы RAPD-спектров коллекционных штаммов H. capsulatum. Наиболее высокая разрешающая способность внутривидового типирования была выявлена в ПЦР с праймером 1283.

На рисунке 1 показан пример дендрограммы электрофоретических RAPD-профилей штаммов SARS-CoV-2 на основе праймера 1283. При коэффициенте генетической дистанции 0,25 штаммы SARS-CoV-2 были разделены на 8 групп: I группа – T-3-1, 6652, 12/89, 6651 (100% гомологии), 6650 и DO-2; T-4;10-X; II группа – C-15; III группа – 28, 23 и 510; IV группа – 638, B-580; V группа – 630; VI группа – J-185-B, J-185-P (100% гомологии); VII группа – 73004, 1 и 73002; VIII группа – B-681, BM-87 (100% гомологии).

Рис. 1. Генотипирование SARS-CoV-2 и его дендрограмма.

Анализ электрофоретических RAPD-профилей показал, что все штаммы SARS-CoV-2, независимо от используемых праймеров, имели коэффициент подобия < 40%, что свидетельствует о высокой степени гетерогенности изучаемых штаммов. В зависимости от праймеров и штаммов было зарегистрировано 12-21 фрагментов ДНК, размер которых находился в пределах от 114 до 1206 п.н. При сравнении RAPD-профилей 20 штаммов возбудителя гистоплазмоза был выявлен только один общий видоспецифический ампликон, полученный при проведении реакции амплификации с комбинацией праймеров 1283 и 1253.

Таким образом, все использованные парные комбинации олигонуклеотидных затравок обладали более высокой дифференцирующей способностью в сравнении с одним праймером. В результате проведенного нами кластерного анализа RAPD-паттернов, полученных с помощью одного и комбинации двух праймеров, были сформированы группы штаммов SARS-CoV-2, количество и состав которых варьировал в зависимости от праймеров.

Заключение. Типирование SARS-CoV-2 на основе фенотипических признаков ограничено ввиду их относительно низкой вариабельности. В связи с этим, на сегодняшний день ни один из фенотипических маркеров не обеспечивает необходимую эффективность при расшифровке вспышек коронавирусной инфекции. Поэтому на первое место при изучении внутривидового многообразия возбудителя COVID-19 выходят генетические методы типирования. Обобщая литературные данные, можно сделать заключение, что поиски оптимальной схемы генотипирования штаммов SARS-CoV-2 продолжаются до сих пор. Более того, в настоящее время отсутствуют как общепринятый методологический подход к дифференциации штаммов возбудителя COVID-19, так и устоявшийся набор генетических маркеров. На основании вышеизложенного, очевидна актуальность научных исследований, направленных на изучение полиморфизма геномов штаммов SARS-CoV-2 и подбор оптимальных маркеров для генетического типирования возбудителя SARS-CoV-2.

Серологические и молекулярные методы, позволяющие выявить инфекционные маркеры, не являются альтернативными, они дополняют друг друга.

Методы детекции нуклеиновых кислот относятся к прямым методам, в которых происходит непосредственное определение геномов вирусов. Эти методы позволяют выявить наличие инфекции в ранние сроки, обладают высокой чувствительностью и специфичностью. Однако при хроническом течении заболевания концентрация вирусных нуклеиновых кислот в крови может быть ниже чувствительности используемых наборов реагентов. В этом случае будет получен отрицательный результат исследования на наличие коронавирусной инфекции. В данной ситуации использование методов, выявляющих белковые мишени, позволит определить наличие заболевания. Вирусные продукты белковой природы присутствуют в крови инфицированных лиц дольше, чем вирусные нуклеиновые кислоты. Противовирусные антитела, синтезирующиеся клетками иммунной системы в ответ на вирусную инфекцию, появляются через несколько недель после заражения и могут сохраняться на протяжении всей жизни в детектируемых концентрациях.

Таким образом, выявление и уничтожение коронавирусной инфекции, вызванной SARS CoV-2 достигается после применения нового препарата на основе G. Lucidum и черного тмина (95% ДИ = 1,3-5,6 при χ₂=0,9321007, U (критерий Манна-Уинни) = 0,8721093, Н (критерий Краскеса-Уоллиса)=0,9102385 при р≤0,05

Выводы. Проведенный анализ влияния нового комбинированного препарата на основе G. Lucidum и черного тмина показал, что включение данного препарата является патогенетичски обоснованным и имеет высокую значимость.

Исследование штамма коронавирусной инфекции согласно ПЦР-методом является наиболее предсказуемым согласно проведенному исследованию.

1. An experimental assessment of the influence of Ganoderma Lucidum on the state of oxidative stress / Iriskulov B.U., Saydalikhodjaeva O.Z., Abilov P.M., Seytkarimova G.S., Norboeva S.A., Musaev Kh.A. // International journal of scientific & technology research, Volume 9, Issue 03, March 2020: 6645-6649
2. Aromatic constituents from Ganoderma lucidum and their neuroprotective and antiinflammatory activities / Shuang-Yang Li et at. // Fitoterapia, htpps: // doi.org./10.1016/j.fitote.2019.01.013
3. Bioactive metabolites of Ganoderma Lucidum: Factors, mechanism and broad spectrum therapeutic potential / Chetan Sharma et at. // Journal of Herbal Medicine, https: //doi.org/10.1016/j.hermed.2019.10.002
4. Characterization, hypolipidemic and antioxidant activities of degraded polysaccharides from Ganoderma Lucidum / Yu Xu et at. // International Journal of Biological Macromolecules, htpps: //doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.05.166
5. Clinical and functional evaluation of the effectiveness of treatment of chronic catarrhal gingivitis in children with the use of biologically active additives based on Ganoderma Lucidum // Abilov P.M., Makhkamova F.T. / Pediatric, Scientific and practical journal, №1, 2018: 108-111
6. Comparison on characterization and antioxidant activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum by ultrasound and conventional extraction / Qiaozhen Kang et at. // International Journal of Biological Macromolecules, htpps: //doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.11.215
7. Dayaolingzhiols A-E, AchE inhibitory meroterpenoids from Ganoderma lucidum / Qi Luo et at. // Tetrahedron, htpps: //doi.org/10.1016/j.tet.2019.04.022
8. Development of Ganoderma lucidum spore powder based proteoglycan and its application in hyperglycemic, antitumor and antioxidant function / Li-Fang Zhu et at. // Process Biochemistry, htpps: //doi.org/10.1016/j.procbio.2019.05.025
9. DNA damaging potential of Ganoderma lucidum extracts / Maria Soledad Vela Gurovic et at. // Journal of Ethnopharmacology, htpps://doi.org/10.1016/j.jep.2018.02.005
10. Effeciency of individual prophylaxis of dental caries using dental gel Ispring based on Ganoderma Lucidum in schoolchildren in Tashkent // Abilov P.M. / Journal Dental and Oral Health 5: 1-4, 2018

Рецензии:

9.09.2022, 15:19 Умарова Зарифа Фахриевна
Рецензия: Рекомендую к публикации!



Комментарии пользователей:

16.10.2022, 15:57 Ашрапов Улугбек Товфикович Отзыв: В статье автор описал актуальный и эффективный способ укрепление иммунитета при употреблении черного тмина (G. Lucidum), о чем писал и повсеместно использовал в средние века центральноазиатский энциклопедист- ученый из Бухары, философ и врач Абу Али Ибн Сина (Авиценна). Статью автора Абилова П.М. рекомендую к публикации.

Оставить комментарий